大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化

實驗概要

        獲得感受態細胞；制備含有目的片段的克隆。

實驗原理

 在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。

 轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

 轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法，CaCl₂  ，RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞(Compenent  cells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl₂和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高，但CaCl₂ 法簡便易行，且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl₂法使用更廣泛。

 轉化率的計算：

 統計每個培養皿中的菌落數。轉化后在抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：

   轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/涂板菌液體積

   轉化頻率（轉化子數/每ug質粒DNA）=轉化子總數/質粒DNA加入量（ug）

   感受態細胞總數=對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/涂板菌液體積

   感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數

  為了提高轉化效率， 實驗中要考慮以下幾個重要因素：

   1. 細胞生長狀態和密度:  不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600  來控制。DH-5α菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5×10⁷ 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。

   2. 質粒的質量和濃度:  用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl  的感受態細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。

  3. 試劑的質量: 所用的試劑，如CaCl₂ 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。

   4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行， 所用器皿，  如離心管，tip頭等最好是新的，并經高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，  否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入，為以后篩選、鑒定帶來不必要麻煩。

        本實驗以E.coli TOP10菌株為受體細胞，并用CaCl₂處理，使其處于感受態，然后與pUC質粒共保溫，實現轉化。由于pUC質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp^r)，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pUC，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）已導入了pUC。

主要試劑

 0.1 mol/L CaCl₂ （滅菌）、無菌水、冰、LB液體培養基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨芐青霉素（Amp）、溫控搖床。

主要設備

        控溫搖床(37℃)、冷凍離心機、水浴鍋、冰箱（-20℃，‐70℃）、超凈工作臺 、 培養箱(37℃)、分光光度計、液器、槍頭、離心管、三角瓶、150px平皿、酒精燈 、 三角玻棒、酒精棉球、火柴

實驗材料

        E.coli.（TOP10）、重組質粒

實驗步驟

           第一天： 

從大腸桿菌TOP10平板上挑取一個單菌落接于2 mL LB液體培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。

    第二天：

1. 取0.5 mL菌液轉接到一個含有50 mL LB液體培養基錐形瓶中，37℃振蕩培養。2－3 h(此時，OD600 ≤ 0.4-0.5，細胞數務必 ≤10⁸／mL。（此為實驗成功的關鍵)

2. 將菌液轉移到1.5 mL離心管中，冰上放置10 min。

3. 離心10 min（4000r/min），回收細胞。4℃

4. 倒出培養液，將管倒置1min以便培養液流盡。

5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl₂ 0.5 mL懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。

6. 4℃ 6000 r/min，離心10 min，回收細胞。

7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl₂ 0.1 mL懸浮細胞，（務必放在冰上）。

8. 分裝細胞，每1200 μL一份。此細胞為感受態細胞。

   轉化：

1. 取100 μL新鮮制備的感受態細胞，加入DNA（重組質粒）10 μL（50 ng ）混勻冰上放置30 min。

2. 將管放到42℃循環水浴90sec。

3. 冰浴2 min。

4. 每管加600 μL LB液體培養基，37℃培養1 h（慢搖）。

5. 將適當體積（200 μL）已轉化的感受態細胞，涂在含有氨芐青霉素的培養皿中。（20uLx–gal,4uLIPTG）

6. 倒置平皿37℃培養12－16 h，出現菌落。

       7. 計算轉化效率

注意事項

1.  無菌操作。 

2.  低溫操作。

3.  注意加AMP時的溫度，溫度不能過高（55-60度），否則加入的抗生素失活，會使克隆株無法篩選出來。