大腸桿菌的生化代謝非常活躍。大腸桿菌可以發酵葡萄糖產酸、產氣，個別菌株不產氣，大腸桿菌還能發酵多種碳水化合物，也可以利用多種有機酸鹽。大腸桿菌在常用的生化特性檢測項目中，甲基紅試驗呈陽性，吲哚產生和乳糖發酵是陽性（個別菌株表現陰性），維-培試驗是陰性，尿素酶和檸檬酸鹽利用呈陰性（極個別菌株表現陽性），硝酸鹽還原試驗表現陽性，氧化酶表現陰性，氧化-發酵試驗表現為F型。
