大腸桿菌轉化實驗

質粒DNA 重組DNA

LB培養基 蒸餾水 IPTG X-gal 氨芐青霉素

旋渦混合器 微量移液取樣器 移液器吸頭 離心管 雙面微量離心管架 干式恒溫氣浴 恒溫水浴鍋 制冰機 恒溫搖床 培養皿 超凈工作臺 酒精燈 玻璃涂棒 恒溫培養箱

一、實驗材料準備

1.  器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養箱。

2.  試劑

培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌ddH₂O，IPTG，X-gal。

3.  材料處理

無菌ddH₂O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

二、操作步驟

1.  事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。

2.  從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 ul）感受態菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3.   加入5 ul 連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。

4.  輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。

5.  在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 ul LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6.  在超凈工作臺中取上述轉化混合液100-300 ul，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

7.  如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal，8 ul 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
 

8.  在涂好的培養皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養箱過夜。

9.  在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。

10.  觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

1.?電擊之前保持低溫狀態。

2.電擊杯使用完，用針頭蒸餾水反復沖洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20℃冰箱存放。

3.玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。