大量培養物中分離BACDNA

溶菌酶限制性內切核酸酶DNA 標準參照物層析樹脂大腸桿菌

乙醇異丙醇DNA提取液堿性裂解液STE溶液TE

脈沖場凝膠電泳儀LB 培養基Sorvall GSA 轉頭或同類產品

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙醇

異丙醇

酚: 氯仿（1:1, V/V)

DNA 提取液

堿性裂解液Ⅰ，預冷

堿性裂解液Ⅱ

堿性裂解液Ⅲ，預冷

STE 溶液，預冷

TE ( pH 8.0)

2. 酶和緩沖液

溶菌酶

限制性內切核酸酶

3. 核苷酸與寡核苷酸

脈沖場凝膠電泳的 DNA 標準參照物

4. 凝膠

脈沖場凝膠電泳儀

5. 培養基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基

6. 離心機與轉頭

Sorvall GSA 轉頭或同類產品，備有 Oakridge 管（Nalgene)

7. 專用設備

層析樹脂

8. 載體和菌株

BAC 轉化的大腸桿菌

二、方法

1. 將 50 μl 過夜培養的飽和 BAC 轉化菌接種到 500 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基中，37℃ 劇烈振蕩（300 r/min) 培養 12~16 h 至細胞達到飽和。

2. 4℃ 下，2500 g（Sorvall GSA 轉頭 3900 r/min）離心 15 min，收集細胞，棄上清，倒置離心瓶使最后一滴上清流盡。

3. 用 100 ml 冰預冷的 STE 重新懸浮細菌沉淀。按步驟 2 方法離心收集細菌。

4. 用 24 ml 含無 DNase 的 RNA 酶（100 μg/ml ) 的堿性裂解液Ⅰ溶解細菌。加溶菌酶至終濃度為 1 mg/ml。

5. 加入 24 ml 新鮮配制的堿性裂解液Ⅱ。蓋緊離心瓶蓋，輕輕翻轉瓶子數次，使內容物完全混勻，冰浴 5 min。

6. 加入 24 ml 冰預冷的堿性裂解液Ⅲ，蓋緊離心瓶蓋，輕輕渦旋離心瓶使內容物完全混勻，至無明顯的兩相分層現象，置冰上 5 min。

7. 4℃ 下，15000 g（Sorvall GSA 轉頭 9600 r/min）離心細菌裂解液 10 min，然后將上清轉移至另一聚丙烯離心瓶中。棄去離心瓶中的沉淀。

8. 加等體積的酚：氯仿。輕輕翻轉離心瓶數次，混勻水相和有機相。室溫下 3000 g ( Sorvall GSA 轉頭 4300 r/min ) 離心 15 min，使兩相分離。

9. 用一寬口徑吸頭將水相移至一新離心瓶中，加入等體積的異丙醇，翻轉離心瓶數次，混勻。

10. 在離心瓶的一側做標記，并且將有標記的一側放在遠離轉頭中心的一面。此標記有助于接下來確定核酸沉淀的位置。室溫下 15000 g ( Sorvall GSA 轉頭 9600 r/min) 離心 15 min, 回收核酸沉淀。

11. 小心棄去上清，將離心瓶倒立在一紙中上，至最后一滴上清流盡。室溫下用 20 ml 70% 乙醇漂洗沉淀和管壁。吸干乙醇，室溫下將瓶倒立在一疊紙巾上幾分鐘，使乙醇揮發殆盡。

12. 小心地將 BAC DNA 沉淀溶于 0.2 ml TE ( pH 8.0) 中。輕彈管壁而不要在渦旋儀上振蕩，以促進 DNA 溶解。通過光譜吸收測 DNA 濃度。

13. 用限制性內切核酸酶消化 DNA。

14. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。電泳要采用適宜大小的 DNA 標準參照物。