大鼠主動脈內皮細胞培養實驗

貼塊法適用于內皮細胞產量低的、管徑較小血管的內皮細胞培養，其方法較酶消化法簡便、經濟。

雄性Wistar大鼠

DMEM 胎牛血清 內皮細胞生長因子 肝素鈉 青鏈霉素 明膠 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液

手術器械 眼科剪 眼科鑷 培養皿 手術刀 培養瓶 CO2培養箱

1. 頸椎脫臼處死大鼠，將整個大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1  min。在無菌狀態下，逐層剪開胸腔，分離取出主動脈，放含無菌 D-Hanks’液培養皿中。

2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后，用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內的凝血數次，再放入另一無菌培養皿中。

3. 用眼科剪縱向剪開血管，平展在培養皿中。用非常銳利的手術刀將其切成1 mm³大小的動脈植 塊(或者用剪刀剪，依照個人習慣)，然后種植到培養瓶或培養皿(培養瓶或皿用1%明膠預置 37℃下過夜， 使用前2h 移入CO₂培養箱中。用時可以先經含 10%小牛血清的培養液沖洗)。將動脈植塊的內膜面與瓶底接觸，種植密度約為 1 塊/cm² 。

4. 置培養箱中靜置2 h(干貼壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養液，液量以略蓋過動脈植塊內膜面，而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后，更換培養液，加入 2-3 ml 培養液。

5. 72 h 左右的時候，當觀察到內皮細胞充分長出，而成纖維細胞剛要長出的時候，將動脈植塊除去，刮除成纖維細胞，換培養液1 次。以后每2 天換液一次，每次換1/2~1/3 的液量。繼續培養 8-10 d， 細胞融合成單層，即可傳代。

1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

2. 在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。

3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細菌落入。

4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。

5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理。

8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

一、實驗討論

植塊培養法適用于內皮細胞產量低的、管徑較小血管的內皮細胞培養，其方法較酶消化法簡便、經濟。但缺點使易混有成纖維細胞和平滑肌細胞，前者的貼壁時間和內皮接近，后者貼壁較內皮慢，而且會被肝素所抑制。

而由于成纖維細胞生長較快，隨著傳代次數越多，其污染的程度越重，從而使培養失敗。因而，抑制和減少成纖維細胞是大鼠主動脈內皮細胞培養的關鍵問題。本法采用的方法是：

   
1. 在合適的時間去除動脈塊，即當內皮細胞已經爬出，初具規模時(大概在72 h 左右的時候，按照本文的培養液條件，因為有生長因子，內皮容易爬出和增殖)，去除動脈塊，并刮除成纖維細胞。

 
2. 使用含肝素的培養液(在培養液中加入100 U/ml 的肝素)，可使內皮細胞純度提高；

   
3. 高濃度的血清和50 μg/ml ECGF 可以充分地促進內皮細胞增殖，而使內皮細胞成為優勢細胞。另外，動脈植塊干貼壁的時間不宜超過2 h，而加培養液這一步驟尤為關鍵，過少會使內膜接觸不到培養液，過多則易使動脈小塊漂浮，導致貼壁失敗。因此，干貼壁后加培養液，加入少量高營養的培養液(0.5-1 ml)，可以避免這些問題。

組織塊貼塊的時候，不可避免會有一些塊貼的方向不是內膜面，那么最后將爬不出內皮，甚至長出較多雜質細胞，需刮除。

另外，部分塊即使大小合適，方向也正確，也可能爬不出來，去除組織塊的時候，應該以大局為重，看到內皮細胞已經爬出較多，而雜質細胞也開始爬出的時候，就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個大概的時間，初學者不可以拘泥。