大鼠大腦皮層神經元細胞培養實驗——機械性劃割培養

SD大鼠

硼酸硼砂緩沖液胰酶-EDTA 消化液D-Hanks’

眼科剪滴管離心機培養皿CO2培養箱

一、實驗步驟

1. 孕16 d SD 大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks’平衡鹽液中。

2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm³ 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內消化20 min，中間搖晃一次。

3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養液(DMEM＋10%FBS)的離心管內終止消化液作用5 min。

4. 用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟 2～3 次。

5. 將所收集的上清經200 目篩網過濾。

6. 過濾后的細胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內加入新鮮培養液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細胞懸液。

7. 細胞計數，調整細胞密度按1.5x10⁵/cm²  種入6 孔板內，放入CO₂ 孵箱中培養。培養48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10^-5mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。

1. 上面的步驟是傳統方法。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進行消化，有人還直接進行吹打，都可行。

2. 上面雖然時大鼠皮層神經元，但是同樣適用于小鼠，但是應該選擇孕13 d 左右的小鼠。

3. 神經元是一種比較難培養的細胞，因此在接種時細胞的密度一定要夠。

4. 在玻片上培養神經元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經細胞的影響 是很大的。如果您現在在玻片上培養的神經元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養中最好還是用同 一來源(廠家)的玻片。

5. 如果有B27 和neurobasal 培養基，那么就方便了(不用加 AraC):

(1)把細胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養基，繼續培養，3 d 半量換液。

(2)把細胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養基懸浮接種。

(3)可以用新生1 d 內的胎鼠皮層直接培養。