大鼠星型膠質細胞培養實驗——胰酶消化法

SD大鼠

苯巴比妥解剖液胰蛋白酶DnaseDM培養液

離心管培養箱手術器材

一、 取14.5d SD大鼠一只。

二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手術臺上，酒精棉球消毒皮膚，開腹取出子宮（約12-14個），放入解剖液中，剖開子宮，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之間離斷，取頭側部組織，去除腦膜組織，取原始中腦區組織，放入離心管裝的解剖液中，待全部取出后，1500轉2分鐘。

三、 用吸管吸出上清液，在組織細胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室溫30分鐘，1500轉，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）。

四、吸去上清，在組織細胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反應10分鐘，1500轉，離心5分鐘，吸去上清，在組織細胞沉淀中加入2 ml DM培養液吹打，計數（計數公式為（N1+N2+N3+N4）/4x10⁴），以3x10⁵個/瓶在培養瓶中培養，做好標記（時間、原代還是第幾代傳代，姓名，細胞名稱等），放入培養箱中培養。

1.  麻醉藥劑量應梢大于普通用量。

2.   一定要仔細剔除干凈腦膜組織，否則會極大地影響培養細胞的純度。

3.  細胞培養技術不同于分子生物學，由于離心速度較慢，離心組織和細胞貼壁不如核酸緊密，取出離心后的上清液時一定要用吸管吸取，禁止用傾倒的方法。

4.  為保護胚胎，胚胎操作應在放置冰塊的托盤中進行，保持低溫。

5.  取中腦組織時應先用兩把鑷子夾住所取區域，然后用刀片切開。

6.  胰酶在細胞離心時會對細胞產生毒性，所以胰酶離心前可加入一定的解剖液稀釋。

7.  細胞離心時最好在冰凍離心機內進行，以保持細胞活力。

8.  吹打細胞前用火燒吸管頭，發紅時逐漸后退，使吸管尖變鈍，減少吹打過程中對細胞的損害，實驗中也發現吹打時有一定的阻力。

9.  鼠胚胎較多時可分批消化，否則體外時間較長，細胞存活率低。

10.  用Neurobasal medium + B27。

11.   胰酶消化時加入EDTA可增強消化效果。

12.  關鍵在于取材的準確和原代細胞的狀態。