大鼠MSCs的獲得和擴增實驗

實驗方法原理

實驗材料 大鼠骨髓

試劑、試劑盒 滅菌CCM含0.2μg ml兩性霉素B(兩性霉素B洗劑）紗布含100U ml青霉素100μg ml鏈霉素和0.2μg ml兩性霉素B的PBSA無鎂和鈣的Hank’s平衡鹽溶液（HBSS)

儀器、耗材 塑料Petri培養皿 15 cm直徑裝有#10和#15刀片的解剖刀1和2英尺刀刃的手術剪鑷子止血鉗15 cm刀刃的咬骨鉗帶Luer接頭的注射器20ml皮下注射針 23號和18號微量離心管1.5ml和0.5ml聚丙烯離心管CO2嚙齒動物安樂死小室

實驗步驟

(a)CO2窒息處死動物，切勿使用藥物。

(b)用酒精擦拭后肢，在不破壞股骨的情況下解剖后肢。將股骨從肢體中分出來。

(C)切除股骨上的肌肉和肌腱。用無菌紗布擦拭除去骨上的剩余組織。

(d)用酒精擦拭已清理干凈的骨，將其放人50 ml塑料管中。

(e)用含抗真菌藥物的冰浴CCM浸沒骨，直到骨髓提取準備完畢。從分離骨到骨髓提取的時間應盡量縮短。

(f)裝有股骨的離心管移至微生物安全廚中，將骨放人15 cm petri培養皿中。

(g)按如下步驟提取骨髓：用咬骨鉗剪掉骨的兩端，暴露內部骨髓。裝有23G針頭的注射器中吸人5ml含抗真菌藥物的CCM，向50ml離心管中沖洗每根股骨。吸取沖洗后的CCM，反復沖洗股骨3次，將其轉移至15 ml離心管中。1000g離心，用1ml含抗真菌藥物的CCM重懸骨髓沉淀。在15 ml離心管中將1 ml骨髓細胞懸液加入到4 ml含抗生素和抗真菌藥物的新鮮PBSA中。每根股骨所得的5ml細胞懸液可混合于同一個離心管中。

(h)在l0℃1000g離心骨髓細胞10 min,用10ml含抗生素和抗真菌藥物的PBSA洗滌細胞3次。

(i)最后，用5 mlCCM重懸骨髓細胞，置于冰上。