[摘要] 目的:采用nPCR技術,對在本院確診的非淋球菌性尿道炎(NGU)患者的泌尿生殖道分泌物標本進行檢測,以探討套式PCR(nPCR)技術在生殖支原體(Mg)和解脲支原體(Uu)檢測中的作用和地位。方法:深圳市福田區NGU患者98例,宮頸或尿道口內拭子分泌物標本用nPCR進行DNA擴增,并與對照組43例進行比較。結果:98例標本中Mg陽性15例,陽性率為15.3%,正常對照組無一例陽性。Uu陽性21例,陽性率為21.4%,對照組僅1例陽性。結論:深圳福田區Mg、Uu在NGU中具有較高的感染率,nPCR具有敏感、快速、特異性強等特點,可用于臨床輔助診斷和流行病學調查。
[關鍵詞] 生殖支原體;解脲支原體;套式PCR;非淋球菌性尿道炎
生殖支原體(Mg)和解脲支原體(Uu)是引起非淋球菌性尿道炎(NGU)的主要病原體之一,由于其培養費時且敏感性低,嚴重阻礙了其在臨床診斷中的研究[1],自PCR技術問世以來,基因診斷已經成為支原體感染較為理想的診斷方法。因PCR僅需少量標本,且無需提純標本DNA(簡單裂解即可),檢測的靈敏度和特異性均大于DNA探針雜交法,因此得到了迅速的推廣和應用[2]。為了進一步探討套式PCR(nPCR)在臨床診斷中的應用價值,筆者應用nPCR檢測了2005～2007年來本院就診的98例NGU患者,現將初步結果報道如下:
1 資料與方法
1.1 標本來源
2005～2007年從深圳市福田區中醫院皮膚性病科門診臨床診斷為NGU的患者98例,其中,男性61例(19～56歲),女性37例(17～49歲),有性亂史者41例,受檢者均在15 d內未用過抗衣原體、支原體藥物。正常對照組43例,男21例,女22例,年齡19～30歲,均為體檢或門診就診孕婦。
1.2 取材方法
標本采集用無菌棉拭子,男性插入尿道2～3 cm,女性插入宮頸內1～2 cm,置留20～30 s,并旋轉3圈后取出,置-20℃溫度下備用。
1.3 標本處理
樣品采集后將其置于1 ml無菌0.9%氯化鈉溶液中充分懸浮,1 000 rpm離心5 min,棄上清液,沉淀物中加入50 μlDNA提取液懸浮沉淀物。100℃溫度下放置10 min,1 000 rpm離心5 min,取2 μl模板上清液加入各自動反應管供nPCR用。
1.4 主要儀器設備
PCR儀,德國Eppendorf公司;DYY-Ⅲ型電泳槽,北京六一儀器廠;Gel Doc 2000凝膠成像系統,美國BIO-RAD公司。
1.5 引物和探針
根據Mg和Uu的16 S rRNA設計特異性引物。外套通用引物為,上游:GAGTTTGATCCTGGCTCAGG,下游:ATTACCGCGGCTGCTGGCAC。內套為,Mg,上游:GCCATATCAGCTAGTTGGT,下游:CTCCAGCCATTGCCTGCTA,產物為242 bp;Uu,上游:GCGGCATGCCTAATACATGC,下游:CTTATTCAAATGGTACAGTCAA,產物為435 bp。
1.6 nPCR反應
第一次擴增:25 μl反應體系中含2.5 μl 10×Tag聚合酶緩沖液,200 μM dNTP, 1 μM引物濃度,1 U Tag DNA聚合酶,10 μl模板DNA。93℃溫度下變性2 min,隨后93℃溫度下放置30 s,55℃溫度下放置30 s,72℃溫度下放置1 min,擴增35個循環,最后于72℃溫度下放置1 min,取10 μl直接點樣電泳100 V,10～20 min,于凝膠成像系統下拍照觀察,有陽性條帶為陽性。每次實驗設立陽性和陰性對照。
2 結果
2.1 nPCR檢測NGU結果
98例NGU患者Mg和Uu陽性率分別為15.3%和21.4%。
2.2 正常對照組nPCR結果
43例NGU患者Mg和Uu陽性率分別為0和2.3%。
3 討論
性傳播疾病(STD)的發病率近年呈上升趨勢,其原因很大程度上歸因于缺乏特異、敏感的檢測方式而被臨床忽視[3]。自20世紀人類首次從患者泌尿生殖道分離出Mg和Uu以來,學者對它的生物學特性和致病性進行了許多研究。Uu和Mg感染往往無特異的臨床表現,同時由于其分離培養困難,如Mg往往需要1～2個月才有培養基顏色的改變,因此給臨床研究帶來了很大困難[4]。若不及時采取有效的治療,部分感染者可能會出現宮頸炎、盆腔炎,有的甚至引起流產、胎兒畸形等嚴重后果[5]。因此對于NGU患者應引起高度重視。對于NGU反復感染的患者,不能忽視對Mg和Uu進行檢測或治療。本實驗研究結果表明,Mg和Uu的陽性率為15.3%和21.4%,與國內外文獻報道結果相符[6]。
PCR 擴增技術問世后2年,有學者發現部分起始模板量較低的PCR實驗不易成功。因此有人在第一對引物(外套引物,outer primers)擴增區域內另行設計第二對引物(內套引物,inner primers)并進行擴增。結果發現,這不僅提高了反應的靈敏度,特異性也隨之增強。這種應用外套、內套引物分別作二輪PCR擴增的方法稱nPCR[7],目前已在組織細胞培養中的支原體污染檢測、動物支原體病診斷和人類疾病與支原體感染相關性研究中得到較多的應用。本研究根據Gen bank中報道的支原體基因序列及其他細菌基因序列進行同源性比對分析,選擇16 S rRNA支原體種屬特異性區域作為擴增區,理論上該引物可檢測出近30種支原體[8]。通過對98例患者進行檢測,結果顯示其具有很好的特征性和重復性,該引物未在其他相關支原體和泌尿生殖道有關病原菌上擴增出相應的片段,因此引物及PCR反應系統具有良好的特異性。由于nPCR原理與PCR相同,只是分別采用外套、內套二對引物分二輪擴增,因此在靈敏度上大大增強,其敏感性可達6～10 U模板DNA。因此nPCR非常適合這種在高難條件下生長的病原體早期的輔助診斷及流行病學調查研究
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