分子熒光光譜法又稱分子發光光譜法或熒光分光光度法，即通常所謂的熒光分析法。該法是一種利用某一波長的光線照射試樣，使試樣吸收這一輻射，然后在發射出波長相同或波長較長的光線的化學分析方法。如果這種再發射約在 s內發生，則稱為熒光；若能在 s或更長的時間后發生，則稱磷光。分子熒光光譜法就是利用這種再發射的熒光的特性和強度來對熒光物質進行定性和定量分析的。
熒光分析法的突出優點是靈敏度高，其測定下限比一般分光光度法低二至四數量級。選擇性也比分光光度法好，但其應用不如分光光度廣泛，因為只有有限數量的化合物才能產生熒光。
一、基本原理
（一） 熒光光譜的產生
熒光物質分子吸收了特定頻率輻射后，由基態躍遷至第一電子激發態（或更高激發態）的任一振動能級，在溶液中這種激發態分子與溶劑分子發生碰撞，以熱的形式損失部分能量后，而回到第一電子激發態的最低振動能級（無輻射躍遷）。然后再以輻射形式去活化躍遷到電子基態的任一振動能級，便產生熒光。由于無輻射躍遷的幾率大，因此分子熒光波長常常比激發光長。激發光源的波長通常是在紫外區，熒光也可能在紫外區，但更多是在可見區。相對于基態和激發態兩個最低振動能級之間的躍遷所產生的熒光稱為共振熒光，此時吸收光譜與熒光光譜重疊。
（1）熒光光譜的形狀和激發光波長無關，這是因為熒光的產生是由第一電子激發態的最低振動能級開始的而和熒光物質分子原來被激發至哪一個能級無關；（2）熒光光譜的形狀和吸收光譜的形狀十分相似，且互為鏡像。因為吸收光譜反映的是第一電子激發態的能級分布情況；而熒光光譜反映的是基態能級的分布情況，而基態中能級的分布和第一電子激發態中的能級分布是相類似的，所以熒光光譜的形狀與吸收光譜十分相似。又因為在相當于由基態中最低振動能能及躍遷到第一電子激發態各振動能級而顯示的熒光峰中，基態的振動能級越高，則兩個能級的差距越小，即熒光波長越長。所以前后兩者不但形狀相似而且互為鏡像。
（二） 熒光強度與溶液濃度的關系
熒光的產生是由于物質在吸收了激發光部分能量后發射的波長相同或波長較長的光，因此，溶液的熒光強度F與該溶液吸光的強度以及熒光物質的熒光效率成正比：
F=（5-16），又根據朗伯比耳定律：則式中是激發光強度； 是摩爾吸光系數；L是樣品池厚度；c是樣品濃度。
當激發光強度一定，且濃度很小時，熒光強度與熒光物質濃度成正比。即F=Kc（5-18）
式中（5-18）即熒光法定量分析的基本關系式。此關系只限于極稀溶液，對于較濃的溶液，其吸光度超過0.05時，使熒光物質分子之間以及熒光物質分子同溶劑分子之間的碰撞增加，導致無輻射去活增加耳發生自熄滅。
熒光強度與入射光強度及濃度成正比，所以制藥光源強度足夠高，入射光強度足夠大，并配備一個高靈敏度的檢測放大系統，便可提高熒光分析的靈敏度，耳不像分光光度法那樣受到濃度的限制。在分光光度法中，吸光度與濃度成線性關系，對很稀的溶液吸收光強度很消（），吸光度A的數值亦趨近于0，難于準確測定，因而分光光度法靈敏度受到限制。因此，熒光法靈敏度大大優于分光光度法。
二、熒光分光光度計
三、熒光定性、定量分析
熒光定性定量分析與紫外可見吸收光譜法相似。定性時，是將實驗測得樣品的熒光激發光光譜和熒光發射光譜與標準熒光光譜圖進行比較來鑒定樣品成分。定量分析時，一般以激發光譜最大峰值波長為激發光波長，以熒光發射光譜最大峰值波長為發射波長。熒光法也可用于混合物的同時測定和絡合物組成的研究等。
熒光法的靈敏度高，是最靈敏的分析方法之一。目前可用熒光法測定的元素已達60多種。熒光法被廣泛用于生物化學、生理醫學和臨床醫學等研究工作中。