質粒DNA的提取、純化和電泳檢測
摘要
本實驗通過堿變性法提取E.coli DH5α(pUC19)的質粒DNA,并且通過一系列的分離純化技術將其質粒DNA與染色體DNA、RNA、蛋白質等雜質分開從而得到純化的質粒DNA分子。通過瓊脂糖凝膠電泳可以通過DNA條帶的位置來大致判斷其分子大小,也可以將實際電泳的結果和理論結果相對比,分析差異產生原因,從而完善實驗方法,嚴謹實驗步驟。
關鍵詞堿變性法分離純化技術瓊脂糖凝膠電泳
引言
質粒是細菌細胞中與主染色體共存、可自主復制的一段大多數呈環形的DNA。細菌質粒的相對分子質量大小從1kb至200kb以上不等。一些質粒永遠獨立于染色體之外,另外一些質粒在一定條件下會可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體的復制而復制,并通過細胞分裂傳遞到后代。質粒在基因工程中質粒常被用做基因的載體。目前,已發現有質粒的細菌有幾百種,已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA分子(DNA)。質粒在基因工程中是一類重要的載體,其作用主要是攜帶一些基因片段(可以是編碼基因,也可以是調控區等),在細胞內環境中進行表達或參與通路的相互作用,通過將質粒轉化到宿主細胞可以探究基因相互作用關系,取得蛋白產物,實現特定基因片段的克隆等。總之,質粒在生物科學研究方面具有廣泛的作用。
提取和純化質粒DNA的方法很多,目前常用的有:堿裂解/堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-***化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中,堿變性提取法最為經典和常用。堿裂解/堿變性法是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的的分離方法。在pH12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性;質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。當以pH4.8的KAc高鹽緩沖液調節其pH值至中性時,變性的質粒DNA恢復原來的構型,保存在溶液中;染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構,與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來,通過離心被除去。最后,質粒DNA用冰乙醇沉淀獲得。由于DNA和RNA性質類似,乙醇沉淀DNA的同時,也伴隨著RNA沉淀,可利用RNaseA將RNA降解。質粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通過酚/***仿抽提除去,最后獲得純度較高的質粒DNA。
電泳(electrophoresis)是帶電物質在電場中向著與其電荷相反的電極移動的現象。各種生物大分子在一定pH條件下,可以解離成帶電荷的離子,在電場中會向相反的電極移動。凝膠電泳是分子生物學的核心技術之一。凝膠是電泳支持介質,具有分子篩效應。含有電解液的凝膠在電場中,其中的電離子會發生移動,此時移動的速度可因帶電離子的大小、形態及電荷量的不同而有差異。利用移動
速度差異,就可以區別各種大小不同的分子。因而,凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段。
正文
1.材料和方法
1.1材料和試劑
實驗材料:E.coli DH5α(pUC19)。
實驗試劑:LB液體培養基、氨芐青霉素(Amp)母液(儲存濃度100mg/mL)、溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mM EDTA (pH 8.0);溶液Ⅱ:0.2MNaOH,1% SDS;溶液Ⅲ:5MKAc(pH 4.8);TE溶液:10mM Tris-HCl,1mM EDTA (pH 8.0);冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris飽和酚、***仿/異戊醇混合液、酚/***仿/異戊醇(PCI)(25:24:1)混合液、3M NaAc溶液、滅菌雙蒸水ddH2O、50×TAE緩沖液、10mg/mL溴化乙錠(EB)溶液、6×上樣緩沖液(6×loading buffer)。
1.2實驗方法
大腸桿菌的增值
用牙簽從LB固體培養基挑取E.coli DH5α(pUC19)菌落于LB+Amp(Amp工作濃度為100μg/mL)液體培養基中,置于37℃、200rpm培養箱下振蕩過夜培養。
實驗前準備
(1)用搪瓷杯取一杯冰。
(2)將小燒杯放在天平上,調至平衡。
(3)配置80ml溶液Ⅱ: 將原液10M NaOH,10% SDS配制成0.2M NaOH,1% SDS。取用8ml SDS,1.6ml NaOH和70.4ml蒸餾水配置。
3. E.coil菌株的收獲( 4°C操作)
(1)取一個滅菌離心管,稱重,標記為W1 14.552g
(2)倒入菌液至距瓶口1/3處,兩兩配平
(3) 6000rpm,離心5min,棄上清
(4)加入5ml 溶液Ⅰ,渦旋, 6000rpm,5min,棄上清,稱重為W2 14.676g,計算W2-W1 0.124g。
4.細胞裂解提取質粒DNA ( 4°C操作)
向菌體沉淀中量加入(按菌體量接近的重新分組,溶液Ⅰ補平)
(1)2.0 mL 溶液Ⅰ,充分渦旋振蕩;用溶液Ⅰ再次配平
(2)4.0 mL溶液Ⅱ,輕柔顛倒混勻,冰浴3-5mi
(3)3.0 mL 溶液Ⅲ,輕柔顛倒混勻,冰浴5mi
(4)12000rpm, 15min;小心轉移上清到新的離心管內,記錄體積V。
(5)加入2V冰乙醇,顛倒混勻;-20℃,15min;。
(6)12000rpm,15min,棄上清。
(7)加入5mL70%乙醇,12000rpm,3min,吸棄上清。
(8)重復乙醇洗滌一次;37℃風干5-10min。
(9)分次加入0.5mL TE溶液兩次,將沉淀吹開吹勻,并移到Ep管中,得質粒DNA粗提物
(10)加入5μl RNase A(10mg/ml),終濃度為50μg/mL,37℃孵育1-2小時。
5.質粒DNA的純化
將1mL質粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中,使得每組兩管。每個EP管進行如下操作:
(1)加入等體積的Tris飽和酚,渦旋振蕩,12000rpm,5mi
(2)轉移上清V1(兩管均為400μL)至新管,加入V1的酚/***仿/異戊醇混合液,渦旋振蕩(<1min),12000rpm,5mi
(3)轉移上清V2(一管為400μL,一管為378μL)至新管,加入V2的***仿/異戊醇混合液,渦旋振蕩(<1min),12000rpm,5mi
(4)轉移上清V3(兩管均為250μL)至新管,加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2),再加入2V4(V4=V3+1/10V3)的冰乙醇,震蕩混勻,-20℃保存30mi
(5)12000rpm,15min,棄上清
(6)加入500μL 70%乙醇洗滌,12000rpm離心2min,棄上清
(7)重復洗滌一次,吸棄上清,37℃風干5mi
(8)每管加入25μL TE溶解沉淀,合并,得50μL純化質粒DNA。
6. 1% 瓊脂糖凝膠的制備
(1)配制2L 1×TAE:取40mL 50×TAE,用雙蒸水將其稀釋至2L
(2)正確組裝制膠槽、制膠板、樣品梳
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文檔介紹：
(3)取40mL 1×TAE至250mL干凈紅蓋瓶中,稱量0.4g瓊脂糖,混勻,輕旋瓶蓋,微波爐加熱沸騰3-4次,至溶液澄清無顆粒
(4)待溶液冷卻至60℃左右,加入20μL 1mg/mL的溴化乙錠(EB)溶液,使EB溶液終濃度為0.5mg/L,混勻后倒入制膠槽中,冷卻凝固待用(冷卻凝固時間要在30min以上)。
7.電泳上樣
(1)取2.0μL純化DNA、2μL雙蒸水、1μL上樣緩沖液(6×loading buffer),用微量移液器吹吸混勻
(2)將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中,添加1×TAE至高出膠面約1mm
(3)將上述混合好的DNA樣品,按照下表順序,點樣到凝膠中。。
8.凝膠電泳與DNA分離
(1)開啟電泳儀電源,選擇合適的電壓120V和時間40mi
(3)將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極,與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負極,與電泳儀負極相連
(4)啟動電泳,待觀察到負極有氣泡升起方可離開
(5)電泳結束,關閉電源,取出凝膠,在紫外燈下觀察電泳條帶。
2.實驗結果
表 DNA樣品加樣順序
泳道
DNA
樣品/
marker
超螺旋marker
UC19
UC19/HindⅢ
1組DNA樣品
2組DNA樣品
3組DNA樣品
4組DNA樣品
5組DNA樣品
超螺旋marker
樣量
6μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
6μL
泳道
10
11
12
13
14
15
16
17
DNA
樣品/
marker
6組DNA樣品
6組DNA樣品(陽性對照)
7組DNA樣品
8組DNA樣品
9組DNA樣品
10組DNA樣品
UC19
HindⅢ
UC19/
樣量
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5,026
5,026
3,049
2,087
圖堿裂解法提取質粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳
泳道1與泳道9 加的樣品是Supercoiled DNA Ladder Marker。supercoiled DNA Ladder Marker 由8種超螺旋的質粒DNA 構成,DNA大小分別為:2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中5,026 bp的條帶最亮。
泳道2與泳道17加的樣品是pUC19質粒。DNA,即超螺旋的共價閉合環狀結構的質粒DNA,其條帶在2.7kb左右,起對照作用。
泳道3與泳道16加的樣品是用HindⅢ酶切的pUC19質粒。HindⅢ酶切pUC19的結果是使超螺旋的共價閉合環狀結構的pUC19質粒DNA的鏈斷裂成線狀的DNA, 線狀DNA電泳速率減慢。但是實驗中所用的HindⅢ沒有將pUC19酶切充分,因此泳道3與泳道16電泳后會形成兩條條帶,其中暗帶是被HindⅢ酶切的pUC19 質粒,明帶是沒有被HindⅢ酶切的pUC19質粒。
泳道11是沒有加RNase的對照組的電泳圖像,由于RNA易形成各種高級結構,同樣大小的DNA和RNA相比,RNA的電泳速率快。泳道11下方的大量明帶即為RNA電泳區域。
除了泳道15存在pUC19質粒所在區域條帶,其他組的都無或無明顯的pUC19質粒所在區域的條帶,包括泳道15在內的所有組的條帶位置都偏低,因為堿變性法有缺陷:容易導致不可逆的變性,不適合大質粒的抽提。堿裂解法是很劇烈的方法,質粒在堿性條件下會變性,時間一長,這種變性就是不可逆的了,我們堿變性時間太長,導致質粒DNA的變性不可逆,所以實際條帶位置和預估不一樣。
除了位置偏下的質粒DNA帶以外,每一組都存在中間位置較弱的雜帶(實心箭頭所指),我們推測此雜帶是沒有被沉淀的,在加了有機物后渦旋震蕩過程中所產生的線性染色體DNA的碎片,DNA,所以它的位置偏后。這一雜帶在泳道4、7、8、10、12和16尤為明顯。
個別組在加樣孔下方也存在較窄的DNA條帶(線性箭頭所指),據推測,這種條帶的產生是質粒DNA沉淀中少量染色體DNA雜質的存在而產生的,由于染色體DNA片段過大,1%的瓊脂糖凝膠的分辨率有限,片段過大的DNA在電泳時速度極慢或很難穿過瓊脂糖凝膠的孔徑,因此,形成離上樣孔近的較窄的雜帶。這一雜帶在泳道4、7、10和12尤為明顯。
個別組在加樣孔處也存在較弱的DNA條帶(方形箭頭末端所指),我們推測可能是沒有除盡的蛋白質把加樣孔堵住了,導致少數DNA無法從加樣孔跑到凝膠當中去。這一雜帶在泳道4、7、10和12尤為明顯。
我們組的質粒DNA(0.124g)在泳道13,和其他泳道相比,我們的質粒DNA的條帶稍微偏弱,這說明我們在組提取質粒DNA時有一定的DNA損失,但是我們組的DNA碎片和染色體DNA雜帶也相對較弱,這可能和我們所提取的DNA量較少有關(和泳道4對照,由于此組提取的質粒DNA量較大,所獲得的雜帶也較明顯。因此,不能因為我們組的雜帶少而確定我們組的結果好),也有可能是我們的雜質除去得較為充分(和泳道14相比,我們組的雜帶明亮程度和他們相近,但是我們的目標帶明顯比他們亮度高)。
3.討論
加入5ml 溶液Ⅰ,渦旋的目的是重懸并洗滌菌體。溶液Ⅰ中葡萄糖的作用是為細胞提供等滲環境,
Tris-HCl作為pH緩沖液,為細胞提供適宜酸堿環境,EDTA(pH 8.0時溶于水)是重要金屬螯合劑,可以與Mg2+、Ca2+等金屬絡合,抑制DNase對DNA的降解作用。離心后盡可能去除干凈上清液,減少培養基對實驗結果的影響。
加入2.0 mL 溶液Ⅰ的作用是重懸并洗滌菌體。
加入4.0 mL溶液Ⅱ的目的:①SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵,使分子去折疊,從而破壞蛋白質分子的二級結構和三級結構而達到裂解細胞的目的。加入溶液Ⅰ后,溶液變得清亮粘稠,變得清亮是由于細胞破碎了,粘稠是由于細胞內蛋白質等有機物析出。加入溶液Ⅰ要慢慢顛倒,使之混勻,不能烈震蕩。震蕩過于劇烈會使染色體DNA斷裂成碎片,導致在質粒DNA中引入雜質。②NaOH的堿裂解作用和堿變性作用:NaOH可以與蛋白質結合(細胞膜含有蛋白質)從而破碎細胞;在pH12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性,而質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。因此可通過之后對pH值的調節達到分離染色體DNA與質粒DNA的目的。
此步驟等待時間不能過長,因為強堿也會破壞質粒DNA。
加入3.0 mL 溶液Ⅲ(5M KAc(pH 4.8))的作用是使質粒DNA復性,而染色體DNA太長難以復性從而沉淀出來。不能復性的染色體DNA與