如何提高PCR特異性

一天P幾百管的人可能不用擔心條帶有沒有，而對于剛入門分子生物學的人來說，PCR能看到條帶，能看到特異性好的一條明亮的帶就是入門zui大的欣慰。師姐會告訴你，引物設計很重要，不能有二聚體和發夾結構；師兄也會和你說退火溫度很重要。提高PCR特異性可謂是仁者見仁，智者見智。以下搜集了網友們的討論，精華匯總如下：

提高PCR特異性的策略

1. 巢式PCR（Nest-PCR）：增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，降低了擴增多個靶位點的可能性，提高困難PCR（如5‘ RACE）特異性 。

2.遞減PCR（TouchDown PCR）：前幾個循環使用嚴謹的退火條件提高特異性，循環設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm 5℃，特異性zui高的目的模板會被優先擴增，這些產物在隨后的循環中繼續擴增占據優勢，遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等 。

3.熱啟動PCR（HotStart PCR）： 熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達到變性溫度，通常選擇熱啟動Taq酶，熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一 。

4.使用PCR增強劑：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等，可能的機理：降低熔解溫度，有助于引物退火，輔助DNA聚合酶延伸通過，二級結構區，增強劑濃度要適當。

freecell

1, 降低模板濃度

2、熱啟動PCR

3、touchdown PCR

4、設計Tm值超過72C的引物

強烈建議第3種

如果模板是cDNA或基因組之類的建議預變性時間長點，可以用95℃10min。另外，Tm不能太低。一般變性溫度95℃相比較94℃而言利大于弊，退火時間太長會導致非特異擴增。合成速度1Kb/s，所以40S足夠了，延伸時間過長也會容易導致非特異性。另外不知道你是只為了擴出目標條帶還是打算要做定量PCR？前者的話將產物割膠后做巢式PCR一定可以解決。如果定量的話建議重新設計引物，因為按我的經驗，即使你按照我上面的程序優化，雖然可能會有改善，但實質性改善的可能性不大。另外，一般cycle數不要超過35，因為如果此時還擴不出產物，引物二聚體一般都出現，再擴下去也只是主要擴增引物二聚體。