如何根據實驗目的選擇流式細胞儀

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自七十年代出現第一代流式細胞儀以來，隨著計算機技術、電子制造技術、激光技術及熒光 素合成技術的不斷發展，現代流式細胞儀已今非昔比，制造工藝、功能、精確度有了質的飛躍。

流式細胞儀 生產廠商推出各種不同型號的流式細胞儀來滿足用戶的不同需要。現生產流式細胞的廠商全球至少有六家，各廠商產品又有不同的系列，各具特點。如何從眾多的型號中挑選出最適合自己的機型，我們還需從分析應用出發，評估自己的需求來決定什么樣的流式細胞儀最具性價比、最適合自己。

一、DNA 倍體分析

DNA分析是流式細胞儀最初且是現在應用最廣檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預后的關系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培養中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學反應并發射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。

流式細胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。

二、細胞生存能力實驗

使用Heochest 33342染料與DNA特異性結合，后因細胞活力不同染料的結合程度也各異，故可評估細胞的活性度。

流式細胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片

三、計數外周血中檢測網織紅細胞

使用TO染料能夠特異性地與RNA結合，結合系數高達3000，故具有很好的性價比。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對計數系統

四、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數，臨床上用于骨髓移植前干細胞數理的測定

使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對計數系統

五、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗

檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應有著重要臨床意義，因為這種反應會導致移植后發熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片

六、血小板自身抗體檢測

血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片

七、移植交叉配型

原細胞毒實驗，主要用于避免移植物超急性排拆反應。流式細胞儀用于監測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領域內的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。

儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片

八、檢測細胞經抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應

淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片

九、檢測細胞內因子(TH1/TH2細胞檢測)

未活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子極少,用流式細胞儀很難檢測出來,因此在檢測前需刺激活化.活化所用的刺激素為PMA 佛波酯+Ionomycin.淋巴細胞在刺激素的作用下,活化分泌細胞因子到細胞外.因流式細胞儀只能對細胞表面或內部的抗原進行檢測,如細胞因子分泌到細胞外則檢測不到,因此必須阻止細胞因子的分泌.抑制細胞因子分泌的試劑為Brefedlin A或Monensin.Th1/Th2細胞首先是CD4+T細胞,因此存在著用CD4來設定細胞群的問題.我們知道CD4不但在T 細胞上表達,還在所有的單核細胞上表達,因此單獨用CD4設門無法將CD4+T細胞區分開來.那么我們用CD3和CD4雙參數設門是否可以呢?回答是否定的.因為在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表達會迅速下調,甚至完全喪失,所以不適合于設門.用CD3和CD8設門,因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數CD3+CD8-的細胞都是CD3+CD4+細胞,因此可用CD3+CD8-細胞群來確定CD4+T細胞群.FITC標記CD8,PE標記IL-4和,PE-CY5標記IFN-r,APC或PE-CY7標記CD3.

流式細胞儀要求：488nm或633nm(僅限APC染料)光源,525nm、575nm、675nm,767nm濾光片.

十、細胞增殖狀態檢測

核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況,在評估腫瘤預后有重要意義.為些標志物的檢測一般同細胞表面標志物同時檢測.FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5標記細胞表面標志物.

流式細胞儀要求：488nm或633nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.

十一、染色體分析

流式細胞儀染色分析運用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結合;Chromomycin A3與GC相結合.從而在雙參數坐標上根據染色體ATCG含量的不同識別各種染色體.平時進行的染色體分析耗時且需要操作者極具經驗,而用流式細胞儀時可快速地識別出異常染色體,如加配分選系統可將這些異常染色體分選出來作進一步分析.

流式細胞儀要求：360nm或488nm光源,450nm、580nm濾光片.

十二、BrdUrd標記追蹤細胞分化

通過細胞分化時涉入溴化尿嘧啶,再使用抗BrdUrd抗體及PI核酸染料可精確識別它們.在流式細胞儀上可清楚地識別出處于G1、S、G2、M期的細胞,在腫瘤研究中有著重要作用.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm濾光片.

十三、淋巴細胞亞群分析

外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各類淋巴細胞亞群定量分析.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm濾光片,液量絕對計數系統.

十四、白血病免疫分型

CD45設門三色白血病免疫分型.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.最少三色熒光,參數越多檢測越為靈敏.

十五、血小板分析

血小板活化實驗、血小板功能分析.血小板識別抗體及相應活化指標.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片,液量絕對計數系統.

十六、白血病、淋巴瘤微小殘留病灶檢測

根據初診免疫分型結果,多參數聯合設門檢測是否有殘留白血病細胞,監測白血病的復發.

T系白血病微小殘留病灶檢測

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片,液量絕對計數系統.

B系白血病微小殘留病灶檢測,液量絕對計數系統

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.最少三色熒光,參數越多檢測越為靈敏.

髓系白血病微小殘留病灶檢測,液量絕對計數系統

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.最少三色熒光,參數越多檢測越為靈敏.

十七、細胞凋亡分析

DNA凋亡峰檢測、ANNEXIN-V/PI雙染法凋亡檢測.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm濾光片.

十八、腫瘤耐藥分析

P-gp、LRP、MRP、BCRP各類耐藥蛋白表達及功能檢測.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.

十九、強直性脊柱炎診斷

檢測淋巴細胞B27表達強度及百分比,診斷強直性脊柱炎.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.

二十、PNH診斷

外周血或骨髓檢測淋巴細胞、粒細胞、紅細胞或單核細胞CD55、CD59表達強度或百分比,確診夜間陣發性血紅蛋白尿.

流式細胞儀要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm濾光片.