如何確定轉基因拷貝數

鑒定轉基因植物的第一步就是要確定被轉基因已經穩定的整合到了染色體上。第二步任務就是評估有多少個轉基因拷貝，以及每個轉基因的表達水平如何。一般經過上游表達載體的設計構建以及下游轉化體系的建立、轉化品系的篩選鑒定等一系列步驟后，即獲得 T 0 代轉基因植物。在轉化過程中，外源 DNA 隨機插入植物內，插入的拷貝數和位點都不固定。插入外源基因的拷貝數低（1或2個）能較好的表達，插入的拷貝數多則會導致表達的不穩定甚至基因沉默現象。因此，檢測T0代植物的外源基因的拷貝數是研究其分子特性的基礎步驟之一。

一、Southern Blot法

Southern Blot是一種常用的DNA定量的分子生物學方法。

其原理是將待測的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉入的拷貝數。Southern法準確性高、特異性強，但存在費時費力的缺點。另外，由于Southern法檢測不經過靶片段的擴增（PCR），一般每個電泳通道需要10-30 μg的DNA ，在實際操作中就需要較大量的植物材料來提取DNA ，而轉基因植物的愈傷組織在無菌條件下經過篩選、重新分化后一般都比較細弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時發生基因重組，造成限制性酶切位點丟失，Southern 法也無法檢測到。這些因素都制約了Southern法在T0代植物中檢測外源基因拷貝數的應用。

二、熒光定量PCR方法

利用新型、靈敏、高通量的實時熒光定量PCR方法可以用于測定原始品系中轉基因的絕對拷貝數。實時熒光定量PCR技術是一種較新的DNA 定量方法。其定量的基本原理是在PCR反應體系中加入非特異性的熒光染料（如：SYBR GREEN I）或特異性的熒光探針（如：Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環次數：CT值（Cycle Threshold）；通過將已知濃度標準品的CT值與其濃度的對數繪制標準曲線，就可以準確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術具有簡便、快捷的優點，能夠有效擴增低拷貝的靶片段DNA ，對每克樣品中20 pg-10 ng的轉基因成分進行有效檢測。同時，與Southern法相比，熒光定量PCR技術可對T-DNA 的不同序列進行擴增，因此能實現對品系中的基因重組的檢測。

選擇一種合適的陽性標準品來繪制標準曲線，是應用實時熒光定量 PCR 技術準確定量模板初始濃度的基礎。近年來，國內外的科學家做了不同的嘗試。Song（2002）等認為理想的標準品應該是已插入外源基因的植物基因組DNA ，并且用Southern blot準確測得插入的外源基因拷貝數。但是在實際研究中，很難得到這樣一套標準品。因此，他提出替代方案，根據外源基因拷貝數和野生型植物 DNA 的大小，按一定濃度比率混合，制成標準曲線。例如，在玉米的外源基因拷貝數研究中他們發現，在加入熒光染料SYBR GREEN I的20 μL PCR反應體系中，應以6 ng野生型玉米基因組DNA 作為模板量。已知玉米基因組DNA 大小為2.5 × 10.9 bp（Armuganathan和Earle 1999），相應于6 ng的玉米DNA ，即可計算出模擬1、2、4、8、16個外源基因拷貝時，應加入的質粒 DNA 的量。

以這些梯度混合液作為標準品，就可繪制標準曲線，檢測樣品的濃度并計算插入的拷貝數了。實驗表明，用這種方法獲得的數據和 Southern blot 的結果相當一致。Giovanna（2002）將農桿菌介導的轉基因番茄作為研究材料，選擇了雙元載體T-DNA 區上的兩個外源基因TSWV-N（Tomato spotted wilt virus）、nptⅡ（neomycin phosphoril-transferaseⅡ）和一個單拷貝的內源基因（endogenous gene）作為熒光定量PCR擴增的模板，檢測外源基因拷貝數。他認為使用植物基因組 DNA 和一定比例質粒的混合液作為標準品，會累積許多無法避免的誤差。比如使用這種標準品必需預先知道待測植物基因組 DNA 的精確分子量，并對植物 DNA 和質粒準確定量，但在大多數情況下得到的數據都只是近似值，再以此混合液作為標準品檢測每一植株的外源基因拷貝數時，就會放大這些誤差。

因此，他提出“相對CT”或“δ-δCT”的方法，這個方法的優點是不需要為每次實驗制作標準曲線，只需要一個優化步驟證明外源基因與內源基因有相同的，至少是相似的反應效率即可。與其它定量技術如 Southern Blot 相比，實時定量 PCR 技術的特異性和高信嗓比特性為轉基因拷貝數定量提供了一些方便。與實時定量 PCR 相比，DNA 點雜交技術要花費不菲的試劑、勞力以及時間。每個條帶至少需要2微克的 DNA 用于放射性檢測或是至少 10 微克用于熒光檢測，因此，需要大量的組織樣品，實驗必須等到每個植株經過傳代能夠提供足夠數量的組織后才可以用于檢測拷貝數。

如果存在重組的話，結果將更為復雜。定量PCR分析的轉基因拷貝數稍高于Southern Blot的分析結果，主要原因是Southern Blot方法在同一個插入位點有多拷貝的T-DNA 片段插入時，轉基因植株的在完全酶切時會產生相似的DNA 片段，電泳分析時很難分辨清楚。定量PCR方法則完全避免了這種情況的發生，除非目的基因DNA 片段在PCR引物處發生斷裂。兩種方法分析結果的比較顯示定量PCR方法分析拷貝數更加有效、適用。