如何選擇凝膠？（二）

11.純化------中草藥有效成分

中藥的化學成分極其復雜。傳統中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。

*生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物堿。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap  Q陰離子交換柱上分離效果良好。

*一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外，多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質，傳統Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復數十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易于工藝優化及在位清洗，壽命也更長。

12.純化------肽類 

肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機溶劑或促溶劑中復性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex  Peptide 

HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30
PG。

13.純化------核酸、病毒 

核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子，和質粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。

14.純化------寡核苷酸  

寡酸苷酸多應用在反義(anti-sense)DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物，并避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。

15.脫鹽、小分子去除 

使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%。只需在進樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可于數分鐘至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計，預裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數分鐘為多至10ml樣品脫鹽。

16.疫苗純化

使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養基中的雜蛋白，處理量可大于床體積10%。柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。目前使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。

17.抗生素聚合物分析 

中國藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比，規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。

18.純化-基因治療用病毒載體

SORRCE 15Q

19.純化-基因治療用質粒

Q  Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl  S500，Plasmidselect         在下游純化中,可應用不同層析技術在純化生物分子的同時,去除各種污染物。

1. 去除——內毒素

內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復合大分子。

內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。可在洗脫目標蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。

利用CNBr或NHS Sepharose

FF可偶聯內毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。

2.去除——蛋白中的核酸

大量核酸增加樣本黏度，令區帶擴張，反壓增加，降低分辨率和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。

胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL結合目標蛋白，可除去大量核酸。

核酸在高鹽下會和蛋白解離,疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白,在純化蛋白的同時去除核酸。

利用核酸酶將核酸切成小片斷,用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。

3.去除——病毒和微生物

病毒和微生物可成為病原,應盡量減除。結合不同層析技術，使用注射用水，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。

病毒大都有脂外殼。可用與目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent)處理，使病毒失活，如Triton和Tween。再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白，去除S/D。

其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質，SOURCE都是很好的精細純化介質,可去除多種微量污染物。