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  • 發布時間:2021-04-02 11:35 原文鏈接: 如何選擇BTX轉基因儀(電轉儀)?

    1、確定目標對象:也就是你所有轉的目的物是什么東西? 細胞系和細胞類型 細胞類型包括人類、哺乳動物、細菌、植物、藻類、霉菌、寄生蟲等 細胞系包括CHO, COS, Jurkat, Saccharomyces Tobacco, Corn, Rice, Tomato,Trypanosome,E coli等 2、其次確定目的 目的包括:轉染 轉化 電整合 電插入 活體/卵的應用 核移植和克隆 細胞融合 然后根據這些來確定該選擇什么類型的儀器。 1、 某位老師使用化學法轉化大腸桿菌E.coli。他希望構建cDNA文庫,但是不能得到好的轉化效率。他以后還想做哺乳動物細胞。如何來選擇儀器: 選擇方案:ECM 399將是較好的選擇,這儀器用來轉化E.coli效果十分理想,同時操作簡單。如果有足夠的預算,可以選擇ECM 630, 這樣更符合他現在和將來的需求。 2、某位老師想要進行一些雞胚的研究工作,他們希望轉染雞的眼睛,以便研究視覺膜的發育過程。他對卵的基因傳遞有一些了解。 選擇方案:完成這個轉染過程需要 ECM 830和活體電極Genetrodes。由于目標區域很小,他需要小的長的genetrode。方波適合動物體的活體轉基因,同時針形的電極是卵的轉基因的首選。 3、遺傳研究中心希望開展某種疾病的基因治療,首先從小動物例如小鼠,以后要在狗、豬等動物體開展。客戶最初希望用基因槍的方法。但是覺得條件不易控制。 選擇方案:基因槍不是理想的活體轉基因的方法。基因槍容易傷害哺乳動物的組織,同時條件可控性差,DNA的轉移效果不理想。推薦使用ECM 830 和2 Needle Array 用于小動物研究,對于大的動物研究的話還需配 caliper electrode。 4、Dr. Mendle使用agrobacteria來轉化煙草的原生質體。他在尋找快速在完整的植株上完成轉基因的方法。此時如何選擇? 選擇方案:ECM 630和特殊電極。電極的選擇需要根據植物轉基因的部位。一般有三種電極可以選擇Tweezertrode、 Caliper Electrode、 Needle Arrays.根據他所轉的植物體大小,硬度等進行 5、Dr. Hofmann正使用脂質體方法轉染原代神經細胞,但是結果差強人意,僅得到1%的轉染效率。但是他不希望使用電轉,因為怕殺死細胞。這些希望不能被胰蛋白酶消化(會引起其他變化)所以他不能使用樣品杯。給怎么辦。 選擇方案:推薦使用ECM 830 和petri dish 電極或者epizap電極。這樣可以用最溫和的方法完成原位轉基因。 6、 Dr. Bloom希望你給他推薦一款融合儀。他過去使用化學的方法來進行的。怎么來推薦。 選擇方案:如果費用允許, ECM 2001是最好的選擇。它提供交流波能排列細胞,可以完成所有的細胞融合試驗。如果費用不足的話,ECM830也可以完成核移植的工作,在融合時需要將兩個細胞進行排列,或者細胞的濃度足夠大。 以下是工作目的和相應的最佳儀器對照說明: ·細菌/酵母轉化 (系統:ECM399/630) 電穿孔現在被認作是轉化細菌及酵母的最有效的方法。革蘭氏陰性細菌(例如大腸桿菌)一般比革蘭氏陽性細菌更容易轉化,因為他們的細胞壁組成不同。對于革蘭氏陰性細菌常常可以獲得10的10次方轉化2/微克DNA的轉化效率,而對于革蘭氏陽性細菌,一般可以得到10的6次方轉化2/微克DNA。Chang等人(1997)成功對一個mtz-敏感的Heliobacter pylori菌株進行電穿孔以傳遞mtz抵抗性。Planelles等人(1999)使用電穿孔轉化大腸桿菌,以避免使用包裝物質。最近電穿孔儀器方面的進展將使研究人員能夠進一步優化細菌轉化(例如脈沖長度產生方面擴展的功能條件)。 RNA、DNA、蛋白質以及小分子都已經通過電穿孔的方法轉入酵母。沒有必要在電穿孔前部分去除酵母細胞壁,因為在完整酵母電穿孔方面的進展可以產生高的轉化率。Faber等人(1994)年優化了S.Cerevisiae的實驗方案,使用Hansenula Polymorpha獲得了比以前的報告增加300倍的轉化效率。 在質粒修復中,質粒從酵母轉入大腸桿菌以進行詳細的DNA序列分析,這是另外一種重要的技術。這種兩個步驟的過程被電穿孔進行了簡化,用于驗證隱性基因的結構,將其導入酵母,看基因性和表現性之間的關系。已經建立了標準的實驗方案使用指數衰減波發生器例如BTX ECM630轉化細菌/酵母。使用方形波電穿孔儀的實驗方案,例如BTX ECM830,來轉化細菌/酵母。研究人員還成功將大的質粒(BAC及YAC)導入細菌。電穿孔杯是細胞及酵母電穿孔的最常用附件,而Model747共軸電極使用則變得越來越普遍。 ·動物細胞轉染 (系統:ECM630/830) 對真核細胞的轉染可以通過多種方法獲得,例如磷酸鈣沉淀、脂質體轉染、病毒方法以及電穿孔。電穿孔已經被正式對傳統的轉染方法不靈的細胞有很好的效果,因此被選為最佳的分子傳遞系統。電穿孔的好處有可重復性、更高的效率、大量樣本處理、無毒性以及容易使用(不需要孵育時間)。 Lofin等人(1999)對NIH/3T3細胞進行電穿孔使mRNA進入,以研究細胞周期及細胞分化過程中mRNA對基因表達調節、控制。Bodwell等人(1999)在對COS-7細胞進行電穿孔是使用較長的脈沖時間后獲得了較高水平的表達。Warner等人(1997)使用電穿孔方法成功轉化了淋巴細胞。Incyte Genomics公司成功使用BTX電穿孔儀轉染了ES細胞進行轉基因小鼠的生產。BTX ECM399\630\830型儀器、電穿孔杯以及多種特用的電極都用于動物細胞轉染用途。 ·蛋白質電整合/電插入 (系統:ECM630/830) 將蛋白質導入細胞以及將蛋白質插入至細胞膜中也可以通過電穿孔來實現。不光肽段,而且包括抗體的多種蛋白,也可以進行導入。Ushio-Fukai等人(1998)對電穿孔插入哺乳動物細胞中的外源蛋白進行了定量。對于這些用途可以使用多種BTX電極。


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