如何預測和鑒定miRNA的靶基因

免疫沉淀當然，確定miRNA與mRNA之間的互作，我們還有更直接的方法，那就是從實驗上尋找物理相互作用。我們可以利用RNA誘導沉默復合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗體進行免疫共沉淀（co-IP）。目前更先進的方法是通過紫外線照射以交聯復合物，然后開展深度測序以鑒定發現的RNA，這種方法被稱為紫外交聯免疫沉淀結合高通量測序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用這種方法來尋找miRNA的靶基因，能夠明顯降低miRNA結合位點的假陽性預測率，并且縮小miRNA結合位點的空間范圍，可在全基因組范圍內鑒定AGO蛋白與不同RNA上的結合。現在有多家公司提供CLIP-seq服務，如銳博生物。 Clontech公司（Takara旗下）也推出了一種新工具，能協助鑒定細胞中的miRNA靶點。這一工具名為MirTrap系統。它利用RISC蛋白的顯性失活突變體，允許miRNA與其目標結合，但限制進一步的加工。此亞基整合到內源的Argonaute/RISC復合物中，并“鎖定”miRNA-目標mRNA。顯性失活亞基上的DYKDDDDK（FLAG表位）標簽有助于整個Ago/RISC復合物的捕獲和分離。這樣就能實現miRNA及其目標的免疫沉淀，從而通過新一代測序或定量PCR來鑒定或定量。