如何驗證蛋白DNA相互作用的功能重要性

　　7月，最新一期的冷泉港實驗手冊《Cold Spring Harbor Protocols》發布。按照慣例，有兩篇protocol是可以免費閱讀的，其中一篇介紹了如何驗證蛋白-DNA相互作用的功能重要性。這篇文章節選自《真核生物的轉錄調控：概念、策略與技術》一書，是由美國加州大學洛杉磯分校(UCLA)的研究人員撰寫的。

　　鑒定與感興趣的控制區域相互作用的DNA結合蛋白已變得相當簡單。然而，特定的蛋白-DNA相互作用的功能相關性還難以建立。作者介紹了一些檢驗這種相關性的方法。但同時強調，沒有一種實驗本身是結論性的。作者介紹了每種方法所獲得的信息，并解釋了它為什么產生了有用但不確定的結果。就所需的勞動量和獲得的信息而言，每種方法差別很大。

　　作者寫道，鑒定與控制區域相互作用的DNA結合蛋白相對簡單，但要明確特定轉錄因子通過與確定的控制元件結合而直接調控靶基因還是一個相當困難的任務。其中涉及到鑒定重要的DNA序列元件及與這些元件結合的蛋白的實驗策略。

　　然而，這種鑒定并不能證明生物相關性。例如，在細胞核提取物種檢測蛋白-DNA的相互作用反映了很多因素： (1)細胞中蛋白的豐度，(2)蛋白提取的效率，(3)活性蛋白的穩定性，(4)提取過程中翻譯后修飾的維持，(5)體外DNA結合分析所使用的條件， (6)蛋白與控制元件的親和力。

　　作者認為，體外檢測蛋白-DNA相互作用不足以說明它的體內相關性。然而，證實哺乳動物細胞內蛋白-DNA相互作用的功能重要性的明確方法尚未開發。目前大家常采用兩種來開展功能相關性研究，那就是ChIP和RNAi。

　　ChIP目前已成為鑒定蛋白與特定基因組區域之間關聯的極為常用方法。一個嚴格對照的ChIP實驗的陽性結果可以提供關鍵的信息，即一個候選蛋白確實非常靠近感興趣的控制元件。不過，ChIP并不是一個功能分析，而僅僅顯示了體內關聯。因為一些研究表明，DNA結合蛋白在體內并非能激活所有DNA元件，還必須獲得其他的功能相關性證據。

　　功能喪失(loss-of-function)研究也是目前很常用的。利用RNAi，可以快速 knockdown編碼幾乎所有蛋白的基因的表達，只要能獲得對RNAi敏感的細胞群體。不過，RNAi也無法輕松克服功能喪失研究所固有的限制，包括兩個或多個因子之間冗余度所造成的差異以及很難區分直接和間接影響。

　　在這篇文章中，作者介紹了12種不同的方法，從ChIP和RNAi開始，它們可以檢測一個特定的蛋白 -DNA相互作用是否在功能上重要。他們介紹了每種方法的原理和操作，并解釋了它們為什么產生了有用但不確定的結果。作者認為，如果主要目標是建立一種相互作用的功能重要性，那么應采取幾種不同的方法。