定制40bp寡核苷酸實驗

1. 制出正義鏈（top strand)。TRAFIG 程序可以在沒有基因要翻譯的情況下被運行，但可以指定輸出為 40bp 長、度的線性鏈。這就可以很方便地提供一個設計序列的正義鏈的列表，它按 40bp 的線性鏈排序。如此每一個線性鏈都可以被標上一個名字或者編號，從而方便地以 E-mail 的形式從銷售商那里定制。少于 40bp 的最后的一段則沒有定購。

2. 制出反義鏈。OTHSTR 程序用來生成互補鏈，因為這兩條鏈對于組裝都是需要定制的。在運行 TRAF1 G 程序產生 40bp 每段的反義鏈之前，必須注意的是（要刪除開頭的少量堿基），輸出的結果要正好是從正義鏈圖譜右側的第 20bp 開始（定制的第一段線性鏈要正好在正義鏈的最后一段寡核苷酸的第 21 個核苷酸處終止）。目的是在整個基因的組裝中精確建立 20:20 的重疊，如同 Stemmer 等（1995) 所描述的。如果制出的圖譜從右邊開始，那么最后一段線性鏈就只有 20 堿基。這 20bp 的寡核苷酸同樣也沒有定制。

3. 定制一個“touch-up”寡核苷酸。有可能所希望獲得的基因在長度上并非那么恰好(40n+20)，所以需要定制一個額外的補償性的 40bp 的寡核苷酸以代替在反義鏈定相的起始位點處漏去的一些堿基，它還超出基因少量堿基對。這個額外的寡核苷酸比反義鏈的右側是要多余超過 20 個堿基，但是，“touch-up”寡核苷酸將作為模板參與組裝過程，并通過超出基因的這些必要的少量堿基對來延伸基因，因為這些堿基與該側的 PCR 引物具有同源性 (參見圖 33-4)。事實上，只要重疊區至少達到 20bp，“touch-up”寡核苷酸在任一邊都可以做（正義鏈在左側，反義鏈在右側），以改變或調整所希望得到的人工基因的邊緣。



4. 可以定制標準長度的（約 25bp)PCR 引物以引導擴增反應。或者，依賴于所采用的克隆策略，如果第一個和最后一個 40bp 的寡核苷酸在反應中作為全長使用時（200nmol/L)，它們可以直接用作 PCR 引物。