定量蛋白質斑點印跡實驗

鼠抗-σ32 單克隆抗體 辣根過氧化酶共價標記的羊抗鼠免疫球蛋白 G ECLTM#1 和#2 試劑 十二烷基肌氨酸鈉 Tris-緩沖鹽溶液

硝酸纖維素膜 斑點印跡裝置 ECLTMHYPERFILM或柯達 X 光底片緩沖液 A

材料與設備

樣品，由各步純化操作所得

硝酸纖維素膜 (0.45um，8x11.5 cm)(Schleicher&Schuell，Inc+)

斑點印跡裝置（Minifold*I，Schleicher&Schuell，Inc.27510)

鼠抗-σ³² 單克隆抗體 3RH2(MAb3RH2)

辣根過氧化酶共價標記的羊抗鼠免疫球蛋白 G(IgG-HRP)(AmershamLifeScience，Inc.)

ECLTM#1 和#2 試劑（AmershamLifeScience，Inc)

ECLTMHYPERFILM(AmershamLifeScience,Inc,) 或柯達 X 光底片

試劑

緩沖液 A

十二烷基肌氨酸鈉 (SKL)(20% 儲存溶液)

Tris-緩沖鹽溶液 (TBS)

TBS+0.1% 吐溫-20(TBST; 防止非特異性蛋白質的結合)

TES+1% 牛血清白蛋白 (BSA)

(配方, 見“試劑的配制”，PP.184~189)

操作程序

1) 按下述方案，將各步純化所得的最重要祥品配制成一個倍比稀釋系列。各樣品取 20ul 加入 180ul 緩沖液 A+0.3%SKL 中進行稀釋。充分混勻后，各稀釋液取 100ul 加于 100ul 緩沖液 A(―個稀度換 1 個吸頭), 依次連續 8 次倍比稀釋。倍比稀釋可方便地在微量滴定板上進行，微量滴定板在使用前每個孔均先經 100 的 TBS+1%BSA 孵育 10 min 進行封閉并用 TBST 沖洗。每個樣品 8 個孔，分別加稀釋 20、40、80、160、320、640、1280 和 2560 倍的稀釋液。需要分析的組分樣品有：樣品 A(粗制溶菌產物)、樣品 B(0.2%DOC 上清)、樣品 C(第一次 2%DOC 清洗液)、樣品 D(溶于 SKL 的包涵體)、樣品 E(FEI 上清)、樣品 F(0.3mol/LNaCl 清洗液)、樣品 G(0.9mol/LNaCl 洗脫物)、樣品 I〔免疫親和層析（IAC) 上柱樣品〕、IAC 柱的 3 號管組分、樣品 J(經透析的 SKL 提取物）、POROS 50Q 柱的峰組分和已知濃度的σ³² 標準（~0.5 mg/ml)。
注：用緩沖液 A+0.3%SKL 進行第一次稀釋是為了溶解樣品 A 中的包涵體。包涵體不溶解可導致σ³² 與溶液隔離，根據我們的經驗，這會使樣品 A 中的σ³² 量估低 8 倍！

2) 預濕硝酸纖維素膜，先在 Milli-Q 純水器制備的水中預濕 2 min, 再在 TBS 中濕 5 min。安裝斑點印跡裝置，確保夾板安裝得很嚴密，使樣品不會從一加樣孔漏至另一加樣孔（先放一張矩形濾紙，再放一張矩形硝酸纖維素膜)。

3) 各稀釋液（20 倍至 2560 倍）取 40ul 加入相應的加樣孔（對一稀釋系列，若從最稀的開始加樣，可不換吸頭)。靜置 3 min, 緩慢抽真空。再用 100ul TBST 洗 3 次（加液時停止抽真空然后再開啟)。

4) 從印跡裝置取出硝酸纖維素膜。在 TBS+1%BSA 中孵育 30 min, 然后在 14 ml—抗溶液（14 ml TBS+1%BSA 和 5ulMAb 3RH2) 中孵育 1 h。傾出 MAb 溶液，存放于 4°C，數日內可重復使用。

5) 用 TBST 洗硝酸纖維素膜 4 次，每次 5 min。

6) 硝酸纖維素膜在 14 ml 二抗溶液（14 mlTBS+1%BSA 和 7ul 羊抗鼠 IgG-HRP) 中孵育 lh。傾出二抗溶液，保存以備再用。用 TBST 洗硝酸纖維素膜 4 次，每次 5 min。

7) 將 7 ml ECL#1 試劑和 7 ml ECL#2 試劑混合（即,0.15 ml 混合物/cm2 硝酸纖維素膜并傾至濾膜上。混勻，孵育 1 min, 然后棄去多余的試劑。將硝酸纖維素膜包在 Saran 包裝膜中。使 ECL Hyperfilm 曝光 2、10 和 60s。底片顯影 (放在顯影液中 2 min, 用水漂洗 0.5 min, 再放在定影液中 2 min, 用水漂洗 10 min)。晾干底片。

8) 底片用掃描定量或目測估計，比較各樣品的哪個稀度所顯示的信號與標準品的相當。例如，若σ³² 標準品在 640 倍稀度顯示中等密度的信號，而樣品 D 在 1280 倍稀度顯示同等的密度，則可估算出樣品 D 的濃度為σ³² 標準品的兩倍 (見圖 3-4)。