定量PCR的新技術

real-timeimmuno-PCR：

1992年，Sano等人將免疫測定技術與PCR結合，創建了一種全新的極其敏感的抗原分子檢測技術，即免疫-PCR(Immuno-PCR)，隨著這種技術的不斷發展，2000年，Sim等使用熒光定量PCR代替普通PCR，發展了免疫定量PCR技術(real-timeimmuno-PCR)。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合起來，其本質是一種以PCR擴增一段DNA報告分子代替酶反應來放大抗原抗體結合率的一種改良型ELISA。

1real-timeimmuno-PCR的基本原理

real-timeimmuno-PCR主要由兩個部分組成。第一部分是類似于普通酶聯免疫吸附實驗(ELISA)的抗原抗體反應。第二部分即熒光定量PCR。real-timeimmuno-PCR與ELISA的區別就在于ELISA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標記抗體，用顏色反應來表明陽性或陰性結果，而前者是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標記抗體，用PCR擴增抗體所連接的DNA，因此可由PCR產物的量來反映抗原分子的量。由于熒光定量PCR的高靈敏度，只要存在著極微量的抗原抗體反應，都能被檢測到。real-timeimmuno-PCR的關鍵之處就在于用一個連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對應關系，從而將對蛋白質的定量檢測轉變為對核酸的定量檢測。

2real-timeimmuno-PCR體系的組成

免疫PCR體系由待檢抗原，特異性抗體，連接分子，DNA和PCR擴增系統組成。

1.待檢抗原被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應用目前介紹的免疫PCR方法進行檢測，需要對免疫PCR進行改進，以便能夠檢測吸附性差的抗原。免疫PCR的后續過程需PCR擴增，目前有些方法應用的固相板或管是專門用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進行擴增，這樣可以簡化實驗過程和提高檢測的精確性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測微量抗原。

2.特異抗體免疫PCR中的特異性是對應于待測抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和素再結合DNA。

3.連接分子連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白A(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來連接生物素標記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識別DNA上的生物素，蛋白部分可識別抗體的Fc段。

4.DNA和PCR系統免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是借助了PCR強大的擴增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質粒DNA或PCR產物等。DNA的生物素化是用生物素標記的dATP或dUTP通過聚合酶標記在DNA分子上，一般是1個分子DNA標記2個生物素，標記率可達百分之百。免疫PCR的PCR擴增系統與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。

一種新的高靈敏度的葡萄球菌腸毒素A(SEA)的檢測方法――定量免疫PCR

摘要：葡萄球菌腸毒素是細菌超抗原蛋白家族中的一種多肽，除了天然的超抗原性外，它還是腸胃毒素蛋白，嚴重危害人的健康。由于現在常用的免疫學檢測方法在靈敏度和特異性方面不高，因此需要建立一種新的高靈敏度方法用于檢測葡萄球菌腸毒素(SE)抗原。

為了提高SE檢測的靈敏度，我們建立了全新的極其敏感的免疫定量PCR方法，該技術結合了特異性強的酶聯免疫反應(ELISA)和靈敏度高的熒光定量PCR。包被SEA的ELISA板被生物素標記的抗SEA抗體特異性識別，這種信號隨著通過對結合在抗體上的DNA進行定量PCR而加強放大。在優化的實驗條件下，免疫定量PCR最低能檢測出30pg的SEA，是ELISA的100倍。

對于感染了含有致熱毒素超抗原的葡萄球菌的宿主，免疫定量PCR能檢測出這種宿主中的極其微量的外毒素的含量。

圖1 免疫定量PCR原理

結果和討論：

免疫PCR因其高靈敏度而能夠檢測微量蛋白，但也往往由于非特異性抗體影響而導致假陽性結果，即使用過量的BSA或牛奶封閉液、減少PCR循環次數，假陽性仍然嚴重。但是實驗發現，使用LowCross緩沖液在不減少檢測靈敏度的情況下能有效的降低非特異性反應。(圖2)

第一種免疫PCR使用常規PCR反應，通過EB染色和瓊脂糖凝膠電泳最低能檢測300pg的SEA。(圖2)

圖2：SEA的免疫PCR檢測：左邊：沒有使用LowCross緩沖;右邊：使用了LowCross緩沖。這次實驗中蛋白的檢測下線是300pg/100ul。

進一步的實驗中采用了定量PCR反應，大大提高了檢測靈敏度，SEA的檢測下線是 6pg/100ul，而ELISA是6ng/100ul，常規免疫PCR也只能達到300pg/100ul，并且SEA蛋白定量準確，無需PCR后處理(圖3)。

圖3：SEA的免疫定量PCR檢測。

高分辨率熔解曲線(HRM)進行SNP基因分型

隨著定量PCR儀設計上的不斷改進，對溫度控制的精密性越來越高，出現了像Rotor-Gene這樣的管間溫度均一性達±0.01℃的定量PCR儀，而該公司新近推出的Rotor-Gene6000更可達到±0.02℃的溫度分辨率。溫度上的高分辨率使得運用定量PCR儀進行高分辨率熔解曲線(HRM)分析基因型成為可能。高分辨率熔解曲線根據序列長度、GC含量和互補性分析樣品。不同的核酸序列，哪怕僅有一個堿基的差異，也會體現在熔解溫度的差別上。基因分型單核苷酸多態性(SNP)是最典型的應用，相比其它方法節約了探針和標記的費用，僅需監測模板熔解溫度的不同即可對不同的樣品進行分型。當然，要達到如此高的分辨率，定量PCR儀必需具備高強度的光源、高速的數據采集、精確的溫度控制和極佳的溫度分辨能力。除此之外，第二代的dsDNA內摻式染料，如LCGreen