1.利用參照物的定量方法
參照物是在定量 PCR 過程中使用的一種含量已知的標準品模板。按其性質的不同可分為內參照和外參照。外參照是序列與檢測樣品相同的標準品模板,外參照物與待檢樣本的擴增分別在不同的管內進行。通過一系列不同稀釋度的已知含量外參照的擴增,建立外參照擴增前含量與擴增產物含量之間的標準曲線,以此用于未知樣品的定量。因此,外參照定量 PCR 屬非競爭性定量 PCR。
利用內參照物的定量方法與上述方法不同,它是將參照物與待檢樣本加入同一反應管中,參照物作為標準品模板與待檢樣品共用或不共用同一對引物,進行 PCR 擴增。按照內參照在擴增中是否與待檢樣品共用同一對引物,根據兩個模板的擴增是否存在競爭性,內參照又可分為競爭性內參照和非競爭性內參照。
若內參照與待檢樣本共用同一對引物,兩模板的擴增存在競爭性,則稱為競爭性內參照,在這種條件下進行的定量 PCR 稱競爭性定量 PCR。理想的競爭性內參照應具備以下特點:
①競爭性內參照模板與檢測樣品能共用同一對引物;
②內參照與待檢樣品長度相近,擴增效率相同;
③內參照擴增產物能方便地與待檢樣本擴增產物分開。在競爭性 PCR 中,首先通過一系列不同稀釋度的已知含量的檢測樣品與已知含量的內參照混合共擴增,做出擴增前檢測樣品含量和內參照含量的比例與檢測樣品擴增產物含量的相關曲線,以此作為標準曲線用于待檢樣本的定量。若內參照與待檢樣本不共用同一對引物,兩模板的擴增不存在競爭性,這時內參照又稱為非競爭性內參照。這種 PCR 因其不存在競爭性,因而屬于非競爭性 PCR。
2.競爭性定量 PCR
采用內參照競爭性定量方法,在準確性方面優于外參照的定量方法,是目前較理想的一種定量方法。其產物分析可采用探針雜交法、電泳法、HPLC 和熒光法等。由于采用內參照的競爭性定量,克服了常規 PCR 擴增效率不穩定的缺陷,各管間的差異得以避免。
競爭性 PCR 方法的總策略是采用相同的引物,同時擴增靶 DNA 和已知濃度的競爭模板,競爭模板與靶 DNA大致相同,但其內切酶位點或部分序列不同,用限制性內切酶消化 PCR 產物或用不同的探針進行雜交即可區分競爭模板與靶 DNA 的 PCR 產物,因競爭模板的起始濃度是已知的,通過測定競爭模板與靶 DNA 二者 PCR 產物便可對靶 DNA 進行定量。
利用競爭 PCR 亦可進行 mRNA 的定量。先以 mRNA 為模板合成 cDNA,再用競爭 PCR 對 cDNA 定量。但當逆轉錄效率低于100%時,通過測定樣品中 cDNA 進行 mRNA 定量,則測定結果會偏低。
3.熒光定量 PCR
熒光定量 PCR(FQ-PCR)是新近出現的一種定量 PCR 檢測方法,可采用外參照的定量方法,也可采用內參照的定量方法。熒光定量 PCR 采用各種方法用熒光物質標記探針,通過 PCR 顯示擴增產物的量。由于熒光探針標記方法的不同,可分為不同的方法,并可借助專用的儀器實時監測熒光強度的變化。因此,這種方法可以免除標本和產物的污染,且無復雜的產物后續處理過程,因而該方法準確、高效、快速。
早期熒光定量 PCR 有許多局限性,如不能準確定量或由于太靈敏而容易交叉污染,產生假陽性。直到最近,熒光能量傳遞技術(fluorescence resonance energy transfer,FRET)應用于 PCR 定量后,上述問題才得到較好的解決。FRET 是指通過供、受體發色團之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發色團轉移至受體發色團,使受體發光。