實時定量PCR應用中的優化方案

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進行精確定量的有力工具[1]。隨著分子生物學技術研究的不斷進展，定量PCR技術取得了突飛猛進的發展，不僅建立了一系列的方法，而且也誕生了許多與這些方法相匹配的新型熱循環儀和實驗材料。實時定量PCR（real-time quantitative PCR）技術便是一種具有革命性意義的定量PCR技術，所謂實時定量PCR是指在PCR指數擴增期間通過連續監測　熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量[2]。

目前它作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關鍵詞的文章就達一千多篇。實時PCR技術較之與以前的以終點法進行定量的PCR技術具有無與倫比的優勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行操作。另外，它還可以通過不同的引物設計在同一反應體系中同時對多個靶基因分子進行擴增，即多重擴增[3,4,5]。本文將對實時定量PCR目前的應用狀況、儀器應用、新材料進展以及實驗條件的優化作一綜述。

實時定量PCR的應用現狀

實時定量PCR技術自1996年誕生以來，由于它顯著的優越性，不僅廣泛的應用于分子生物學的各個研究領域，而且也開始作為一種診斷手段應用于臨床。其應用涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態性分析，基因突變分析等多個領域[3]。

Giulietti 等人對用實時定量PCR測定細胞因子基因的表達作了詳細的描述。細胞因子是一種調節蛋白，它對免疫反應、炎癥反應具有重要的調節作用，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的關系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質水平的檢測，另外，通常用的蛋白質檢測方法（如ELISA）的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產物的檢測，所以應用PCR定量進行基因診斷就顯得十分有意義。

眾所周知，cDNA微排列和差異表達PCR技術是對基因表達變化分析的兩種關鍵技術，但是這兩種技術只能對基因表達變化進行定性分析，而不能進行定量分析。Rajeevan等人[7]利用實時定量PCR技術卻成功地將基因表達的變化進行了量化，不僅有效地證明了上述兩種方法的有效性，而且提供了一種具有高通量的對基因表達變化進行檢測的新技術。

實時定量PCR技術的出現不僅增強了有關對基因量變化的研究方法，而且也增強了對基因質所發生變化方面的研究。例如Laird和他的同事們[8]建立了一種被稱作Methylight的實時定量PCR方法，它能通過特異的引物和/或Taqman探針檢測基因CpG島的胞嘧啶是否發生了甲基化。由于實時PCR的敏感性和特異性，使得這種方法對胞嘧啶的過度甲基化常常具有極高的靈敏度。zui近有研究表明這種方法可以從食管癌病人的食管粘膜中檢出含有發生了過度甲基化基因的細胞[9]。又如Sevall等人[10]證明可以用實時定量PCR方法區分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報告基團標記Taqman探針，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發生雜交，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交決定的，所以如果出現一種信號強于另一種信號則表明兩條基因具有同源性，若兩種信號都增強則表明為異源性。

目前實時定量PCR在臨床診斷方面的應用主要體現在對感染組織或細胞負載病毒的定量測定上，這一技術對DNA和RNA病毒都可以檢測，目前已有標準的操作手冊供人們使用，但是必須明確，國際上既沒有統一的病毒荷載的標準，也存在著對其標準曲線和定量準確性的各種爭論。這里值得一提的是一種稱為NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技術[11]，它是一種利用電化學以光的等溫PCR反應，在反應過程中能產生一種與靶RNA反極性的RNA擴增子，分子beacon常用于這種技術　 ，這種方法常常用于對逆轉錄病毒的定量測定。

常用的熱循環儀

對PCR產物進行實時定量的測定之所以能成為現實，并且應用如此廣泛，其中一個重要的原因就是新的熱循環儀的研制與推廣。目前，國內外常用的熱循環儀主要有以下幾種：

1. PE公司生產的Applied Biosystem系列：

（1） ABI　Prism 7700 Sequence Detection System （SDS）是*種作為商業用途的實時PCR測定儀，它由激光激發熒光，并且可在500-660nm范圍內調節波長，可以用于基于水解探針、雙鏈DNA結合染料、分子beacon原理的分析。一次可以測定96個樣本，并且速度較快，一批樣本的完成只耍要2小時。但是它不能實時對擴增結果進行分析，而只能在全部擴增結束后才進行數據分析。

（2） Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作與 ABI　Prism 7700 SDS相同，但是它是利用鹵素燈為激發光源，而且只設計了一個檢測波長。

（3） ABI Prism 7900 SDS: 這是一種為實現高通量檢測而設計的儀器，其基本構成與ABI　Prism 7700 SDS相同，但程序設計完全實現自動化要求，而且有兩種樣品盤可供選擇（96孔和384孔）。如果加上一個裝載輔件，可以在24h之內完成84個384孔板的樣本測定。

2. Roche 公司生產的Lightcycler熱循環儀，它以能裝載20-25ul的毛細硅管作為反應管進行擴增，光源選用冷光源系統，可以減少光源對樣本的影響。由二極管發射藍光激發熒光，并提供三個濾光片，可利用熒光分光測定的原理，同時對一個反應體系的多種熒光進行檢測，所以它完全可以進行多重PCR。由于Lightcycler使用了其獨特毛細管反應體系和空氣快速熱循環系統，使樣本能在非常短的時間內有效地實現溫度變化，從而能在20-30min內快速完成30-40循環，達到樣本擴增的目的[12]。Lightcycler通常使用的實驗材料主要是SYBRI Green I熒光染料和Taqman熒光探針和雜交探針。雖然Lightcycler有相當多的優點，但是這也有一些不足之處，由于它只提供一個32孔的樣品盤，這使得不能在一次進行較多的樣本測定。

3. Bio-rad 公司生產的iCycler iQ：這種儀器提供連續的檢測波長調節，程序滿足實時數據處理，可以同時在一個反應體系中檢測四種熒光信號，由于一批能完成96個樣本的測定，所以能提供相對較快的擴增反應。

4. Strategene公司的MX4000 Multiplex: 這種儀器的檢測波長可在350-750nm范圍內進行調節，以鹵素燈作為激發光源，常選用的實驗材料包括Taqman探針、雜交探針和分子信標（molecular beacon），其樣品盤的規格有多處可供選擇，包括96孔盤、8聯管或單管，其程序也提供實時數據分析。

5. Cepheid公司的Smart Cycler System: 這種儀器正如其名一樣具有強大的功能，它有16種反應模式可供選擇，而且每種模式都有各自的程序，任一模式不僅能同時檢測四種熒光信號，而且不同的使用者可對同一批樣品同時運行不同的模式進行檢測。Smart Cycler System的這種設計雖然有其優點，但是其缺點也是顯而易見的，由于其將樣品盤分得過細，所以不利于同時進行較多樣品的分析。

6. Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 這種儀器與Lightcycler相比，屬于中心型熱循環儀，即從反應體系內部進行熱變化；其具有雙光源系統，藍光在470nm處激發熒光，綠光在530nm波長激發熒光；具有兩種樣品盤（32孔和72孔）供選擇；可以對多種熒光材料進行測定 。 
 

熒光材料新進展

為了滿足實時PCR更高敏感性要求，各試劑公司都致力于開發新型的化學發光材料，目前作為商業用途的這些化學物質都能適用于上述的各種儀器。它們主要有以下幾種：

1. 水解探針或Taqman探針：這種探針用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5’à3’活性所降解，探針的5’端有一熒光報告基團，3’端有一熒光淬滅基團，當兩個基團相互先靠近的時候，由于發生能量傳遞作用，報告基團不能發出熒光，但隨著擴增反應的進行，5’端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發生能量傳遞作用，從而能發出熒光，被信號探測器所捕獲。常同探針5’端相結合的基團有FAM（6－羧基熒光素）,TET（四氯－6－羧基熒光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基熒光素），HEX（六氯－6－甲基熒光素）或VIC，常與3’端相結合的熒光淬滅基團常為TAMRA （6- 羧基四甲基若丹明）或DABCYL（4-（4’-惡烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相較之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的減少自發熒光信號[6]。目前，水解探針已被用于基因檢測[13]、病毒定量[14,15]、癌細胞基因微突變檢測[16]、細胞因子基因定量[17]等，其結果都具有高特異性與高敏感性。

2. 分子信標: 是一種單鏈DNA形成的發夾結構，在其一端有一報告基團，在另一端有一淬滅基團[18]，當它形成發夾結構時，由于熒光報告基團與淬滅基團想互靠近，兩者之間發生熒光信號能量共振轉移（fluorescent resonance energy transfer FRET），當熱循環溫度達到分子beacon的解鏈溫度時，其構象發生改變，能與模板結合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報告基團發出熒光信號[19,20]。分子信標特別適用于檢測點突變，這能區分只有一個核苷酸差異的不同DNA序列，而且其敏感性要遠比同等長度的寡核苷酸探針高[21,22]，分子beacon已被用于
突變檢測[23,24]、病原體定量[25,26]、病毒檢測[27]和胚胎的性別判斷[28]，它同時出用于多重PCR檢測逆轉錄病毒[29]。

3. scorpions: 它由兩個寡核苷酸分子組成，一個是引物，另一個是帶熒光分子的探針，但是此探針也具有引物的功能[30]。引物與形成發夾結構的探針相連，在探針上由于熒光報告基團與淬滅基團相互靠近，不能發射熒光。在反應的變性階段，探針的發夾結構會解開，構象發生改變，在退火時則與模板相結合，形成線性分子，報告基團同淬滅基團分離而發射熒光。同Taqman探針和分子beacon相比，scorpion能更快地發射出熒光且信號更為強烈[31]，其特異性也很高，因為只有在反應體系中存在特異的目的基因，探針-引物才會與之相結合。Scorpion是一種較新的熒光材料，具有良好的應用前景[31]。

4. 雜交探針：該材料使用四個寡聚核苷酸分子，兩個引物與兩個探針，雜交探針分別單標，一個攜帶熒光供體基團，一個攜帶熒光受體基團，當這兩個探針雜交到目的基因上時，能形成首尾相連的結構使兩個熒光基團相互靠近，發生FRET。受體基團能轉移能量，使得供體基團在不同波長條件下被激發，發射出的熒光量直接與目的基因的產量成相關關系[32]。這一方法已被Roche公司生產的Lightcycler所應用，進行病原體檢測[33]、病毒荷載量[34]的測定等領域。

5. SYBR Green I: 這是一種DNA結合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態下，它不發出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后，便可以發出熒光[35]。它的zui大優點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應體系中，從經濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多，但由于它能與所有的雙鏈DNA結合，所以一旦反應體系中出現非特異擴增，那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性[36]。要避免這種不利因素，一方面可以通過Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等熱循環儀內設定的程序過對擴增曲線進行分析，以區分由PCR產物和本底造成的熒光信號，另一方面就是選擇良好的引物和探針并優化反應條件以消除非特異性影響[37]。