實時定量PCR技術簡介

技術方法簡介

      所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。

qPCR實驗步驟

• 反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA;

• 擴增:用PCR的方法擴增cDNA;

• 檢測:實時檢測和定量擴增的產物.

qRCR影響分析可靠性關鍵點:

• 分析結果依賴于模板的數量、質量以及合理的檢測方法設計;

• 反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩定性;

• 數據分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果;

因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質量評價以達到zui小化變異性，zui大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數據分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。

由于各個學術團體和科研機構使用不同的操作流程，但下列因素是值得注意的事項:

• 新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品的RNA提取方法有所差別;

• 整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細胞，組培細胞的處理差別;

• 總RNA或者mRNA樣本的預處理;

• 注意RNA反轉錄成cDNA的不同的策略;

• 注意不同的酶以及酶的緩沖液的不同組合;

• 注意qPCR儀器參數的變異系數、靈敏度;

• 注意qPCR儀器的多類型的檢測化學方法，反應的條件，熱循環儀的分析以及匯報方式;

• 注意每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理，內參的使用，歸一化的方法，質量控制等等因素嚴重影響RT-qPCR的可信度，重復性。

引物設計簡介:

DNA引物長度:15-25 個堿基;GC含量:50%左右如果引物的與AT區域富集結合,可以考慮用LNA替換幾個堿基,較少引物的長度以及避免引物次級結構和3’端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭,分之內雜交,倒轉重復等等會引起引物的引發探針對結合效率達到降低,因此我們選擇引物二聚體的△G為負值,即: < 10 kcal/mol.沒有連續的G/C。

引物設計注意事項:

檢查比對序列的多態性以及可能的錯誤避免這些區域來進行引物和探針設計。

在靶序列中避免直接待重復區，在重復區進行雜交容易使得引物非獲得產物性結合，降低DNA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。

考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過生物信息學分析內含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設計跨zui長內含子區，這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當用基因組DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。zui經濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。

在RT步驟時，用生物信息分析工具檢測在特定溫度下靶序列的折疊情況，避免一些高度次級結構的區域，那些區域探針和引物結合效率較低7。

盡可能用60-150bp的擴增產物，GC含量在60％或者稍小來確定高效的變性，更高度反應效率。GC含量高度序列容易產生非特異性的反應，短序列擴增是的擴增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴增多標準曲線。用oligodT進行逆轉錄zui好設計擴增子位于靠近模板的3’區域。