應用于實時定量 PCR 檢測體系中的熒光探針主要有兩種:一種是 TaqMan 探針,一種是分子信標探針。
Tyagi 和 Krammer(1996)首次建立了分子信標探針,在同一寡核苷酸探針的5'端標記熒光素、3'端標記淬滅劑(DABCYL)分子信標探針能形成發夾結構,探針的嚕撲環(LOOP)與目的 DNA 堿基互補,嚕撲環兩側為與目的 DNA 無關的堿基互補的臂。
無目的 DNA 時,探針形成發夾結構,熒光素靠近淬滅劑,熒光素接受的能量通過共振能量轉移至淬滅劑,DABCYL 吸收能量后以熱量形式消失,結果不產生熒光。當探針遇到目的 DNA 分子時,形成一個比兩臂雜交更長也更穩定的雜交,探針自發進行構型變化,使兩臂分開,熒光素和淬滅劑隨之分開,此時在紫外照射下,熒光素產生熒光。
影響分子信標探針構型變化的參數主要有:臂長、臂序列 GC 含量、撲環長度和溶液鹽濃度,尤其是二價陽離子如 Mg2+對兩臂形成的雜交莖有較強的穩定作用,在 Mg2+存在條件下,4～12個核苷酸可形成穩定的雜交莖。嚕撲環長度至少應是臂長的2倍,才能保證探針與目標 DNA 雜交及熒光素與淬滅劑分開。TaqMan 探針是一段5'端標記報告熒光基團,3'端標記淬滅熒光基團的寡核苷酸。報告熒光基團如 FAM 共價結合到寡核苷酸的5'端。TET,VIC,JOE 及 HEX 也常用作報告熒光基團。所有這些報告熒光基通常都由位于3'端的 TAMRA 所淬滅。當探針完整時,由于報告基團與淬滅基團在位置上很接近,導致其報告熒光的發射主要由于 Forster 型能量傳遞而受到抑制。
在 PCR 過程中,上游和下游引物與目標 DNA 的特定序列結合,TaqMan 探針則與 PCR 產物相結合。Taq DNA 聚合酶的5'—3'外切活性將 TaqMan 探針水解。而報告熒光基團和淬滅熒光基團由于探針水解而相互分開,導致報告熒光信號的增加。TaqMan探針的3端則經過化學修飾,以防止其在 PCR 過程中被延伸。探針與產物的結合發生于PCR 的每一循環,但并不影響 PCR 產物的指數積累。
報告熒光基團與淬滅熒光基團的分離導致報告熒光信號的增加,而熒光信號的增加可被系統檢測到,它是模板被 PCR 擴增的直接標志。
引物和探針都必須與模板結合(雜交),才能實現 PCR 擴增和探針的水解;與探針特異結合的 DNA 模板得到擴增時才能產生熒光信號。基于這兩點要求,即使發生非特異性擴增,也不會影響檢測結果。
熒光定量檢測的主要影響因素在于所用探針的純度以及鎂離子濃度,二者在很大程度上決定了檢測結果的真實性和可靠性。
探針的純度直接影響探針熒光本底的高低。任何標記報告基團而無淬滅基團的分子都是污染源,未淬滅的報告熒光使探針的熒光本底增高,導致難以辨認由于探針裂解而產生的報告熒光的變化。
同時由于探針標記不完全,即只標記了報告熒光素或只標記了淬滅熒光素或二者均未標記上,這樣,即使熒光探針與擴增產物結合,也不能檢測到熒光信號的增長,很容易造成假陰性。另外,鎂離子濃度的高低也直接影響了檢測的靈敏度。