實時熒光定量PCR

    實時熒光定量 PCR ，簡稱 RT-QPCR, 屬于 Q-PCR 的一種，目前該技術已得到廣泛應用，如：擴增特異性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。熒光定量 PCR 常用的方法是 DNA 結合染料 SYBR GreenⅠ的非特異性方法。

    SYBR Green I 是一種結合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的熒光染料， 可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結合。 在 游離狀態 下，SYBR Green I 發出 微弱的熒光 ，但 一旦與雙鏈 DNA 結合 ， 嵌入至 dsDNA， 熒光大大增強 。

    因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關， PCR 擴增不同時期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 熒光信號強度不同。 可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量， 并可根據對照進行相關的計算和分析。

實驗開始前，需準備好實驗所需的各種試劑和耗材。

試劑包括：特異性 PCR 引物，新鮮提取備用的總 RNA。

使用的試劑盒有：用于合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反應所需要的所有實驗組分以及相關的正對照反應組分。

配套 LightCycler? 480 使用的試劑盒 LightCycler? 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各種實驗組分，如 1 號管中包含熱啟動 Taq DNA Polymerase及反應緩沖液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式試驗開始前，冰上解凍各個試劑及試劑盒組分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。

所需儀器與耗材有：羅氏 LightCycler? 480 全自動實時定量 PCR 儀以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。賽默飛公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 儀、單道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒裝吸頭等。

接下來進入實驗部分，本實驗操作流程是：首先用新鮮提取的 RNA 反轉錄合成 cDNA 第一鏈，然后進行實時熒光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反應體系的配置； PCR 程序設置； 運行 PCR 實驗，樣品編輯和結果分析。

首先是反轉錄合成 cDNA 第一鏈：

實驗操作時注意：所有 RNA 相關的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相關操作嚴格按照試劑盒使用說明進行相關操作。

按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix，總體系 13μl，本實驗是聯合使用 anchored oligo dT 引物和隨機六聚體引物進行的反轉錄。 先配置 NTC 對照，加入 9 號管水 10μl、 6 號管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 號管的 0.6mM 隨機六聚體引物 2μl，混勻。 然后進行樣品一號管的體系配置， 依次加入 1μl 已調整濃度的總 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 隨機六聚體引物、最后加 9μl 水補充至總體積 13μl，混勻。其他樣品管，參照 1 號管的配置方法，依次加好反應體系。注意：可將總 RNA的模板量適當調整至 10ng-5μg，mRNA調整至 1-100ng。

若 RNA 樣品濃度較低，則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩定模板 RNA。

將配好的反應 mix 在 PCR 儀中 65℃變性 10min，可有效減少 RNA 的二級結構。加熱后迅速置于冰上驟冷，放置 5min。在反應 Template primer mix 中按體系配方順序，依次加入以下試劑： 2 號管的 5×反轉錄酶 buffer， 4 號管 dNTP mix， 3 號管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑， 1 號管 20 U/μl 的反轉錄酶，最終體積為 20μl。

若樣品數較多，先配置反應 mix 再分裝，小心吸打混合，切勿渦旋振蕩。 混勻后于瞬時離心機上短暫離心，使樣品和反應液落至離心管底部。將離心管放置 PCR 中，根據使用的引物以及目標 mRNA 的片段長度進行程序設置。本實驗反應溫度和時間設置為： 25℃， 10min， 55℃反應 30min。反應完畢后，于 85℃下加熱 5min 滅活反轉錄酶， 再置于冰上停止反應。此反應產物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更長時間。

cDNA 產物無需進行純化即可用于后續的 PCR 反應。 20μl 的 PCR 反應體系可取 2-5μl cDNA 反應產物進行擴增。此試劑盒中的反轉錄酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，減少其對后續 PCR 的影響。

本部分實驗，我們選用羅氏的 SYBR Green I Master 試劑盒進行基礎的絕對定量分析。

本實驗共設置 5 個標準樣品，包含 1 個標記為 0 的空白對照， 5 個反轉錄樣品，包含 NTC 對照，由于樣品數較多，先配制不含模版的總體系，再分裝為10管，加入各個樣品的模板后，再將每個樣品分裝為 3 個復孔。

按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 級別水。 總體系配好后，在用移液槍輕柔吸打均勻，然后分裝為 10 管，每管 55μl。往 10 管中分別加入各個樣品對應的調整好濃度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分別加入 6μl 已經逐級稀釋好的標樣模板。 反轉錄樣品分別加入 6μl 濃度調整好的模板 DNA， 包含 NTC。混勻，然后將每個樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板，將多孔板置于合適的離心機中 1500×g 配平離心 2min 將準備好的 96 孔板放置在LightCycler? 480 設備中。

雙擊打開 LightCycler? 480 的 1.5 軟件并登陸，自動進入軟件界面，點擊 new experiment,在 Detection Format 選項中選擇 SYBR Green I 模式, 點擊 OK 完成檢測通道的設定,接下來設置反應體積，對于 96 模塊，反應體系為 10μl-100μl 之間，本實驗是設定 20μl 的反應體系。

在 Program Name 中輸入反應名稱 pre incubation，預變性設定 1 個循環，無需進行熒光的收集，執行的溫度和時間設定為 95℃ 10min，視圖會根據設定進行實時的調整。

點擊增加按鈕，輸入 Amplification，定義擴增循環的次數為 45 次，并選擇熒光的收集功能 Quantification，然后設定 PCR 擴增循環的溫度與時間為 95℃ 10s，點擊增加按鈕，設定退火溫度和時間為 60℃ 10s，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None，繼續點擊增加按鈕，設置延伸溫度和時間為 72℃ 20s，Acquisition Mode 選擇 Single， Ramp Rate 均按自動調整值，無需再設置。

設置溶解曲線，在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves， 1 個循環數， Analysis Mode 選擇 Melting Curves，時間和溫度設置為 95℃ 5s， 點擊增加按鈕，新增設置溫度和時間為 65℃ 1min，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None。點擊增加按鈕，新增設置溫度為 95℃，Acquisition Mode 選擇 Continuous,其他設置無需改動。

設置保溫的過程 Cooling，只需 1 個循環，無需收集熒光，設定溫度和時間為 40℃、 1min。設置完成后點擊右邊的保存按鈕保存設置的程序。此時整個 PCR的循環體系、溫度的設置已經設定完畢。

點擊 Start run 開始運行 PCR 反應，此時可在軟件上實時監測樣品擴增情況。

實驗結束，點擊 Sample Editor，進入樣本編輯區。

Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據樣本在板中排布的方式進行樣本編輯。設置陰性對照、空白對照、標準品以及未知樣品等。

在 Select Sample 中，選中需要設置的樣品孔。在下一欄中的 Sample Name 輸入被選擇樣品組的名稱，并在 Sample Type 中選擇樣品組的類型，最后點擊 Make Replicates 設置復孔。標準品設置時，需填寫拷貝數，只需填寫好稀釋倍數，初始濃度即可。 編輯好樣品后，即可進行數據分析。如有需要，也可進行子集編輯。

樣品編輯好后，可進行實驗結果分析。

點擊左邊欄下方的 sum 按鈕，相應出現實驗的所有信息，包括：設計的反應程序，實驗結果分析等。

點擊 analysis，可以根據樣品已有的數據進行細致準確地分析。

點擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗口，在 Subset 選項中選擇分析樣品的分布區域，點擊確定，即可出現分析圖：相應樣品的擴增曲線。

Standard Curve 是根據標準品得出的標準曲線，曲線左側標有擴增效率、斜率、截距、線性關系、以及錯誤率。一般“Error”值越小，說明實驗的準確率越高。

擴增效率如果越接近“2”，說明這次的擴增反應越好。

在數據表格，可顯示單個樣本的 Cp 值，以及相應的樣本濃度值。

按復孔進行數據統計，顯示 Cp 平均值，方差，濃度的平均值以及方差。