歸一后的熒光信號再扣除本底，就得到DRn：DRn = Rn,樣本- Rn,空白。DRn是最后構建PCR實時擴增曲線的縱坐標。
無論絕對定量還是相對定量，在得到實驗結果后，還要考慮數據之間的可比性問題。在實驗操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數目并不一樣，所以拷貝/μL或拷貝/ng的定量數據相互之間實際上并不可比。只有將這些數據歸一到以拷貝/細胞或拷貝/基因組為單位后，才可進行嚴格意義上的比較。
這種校正可以通過適當的參比來完成。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數是恒定的，受環境因素影響較小，其定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組的數量。校正方法為：[DNA]樣本/
[DNA]IPC，或者DCT = CT,樣本- CT,
IPC。因為CT值與起始DNA拷貝數的對數是反比關系，可以證明，這兩種計算方法在數學上是等價的。
為了減少誤差，目標基因和參比基因最好在同一反應管內同時進行定量測定，所以這種對照稱為陽性內對照(Internal
Positive
Control，IPC)。要進行IPC歸一化校正，定量PCR儀必須具備多色檢測能力，最好是4色。否則，目標基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內”標了。
5污染的預防和熱啟動
為保證定量的準確性，要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和熱啟動。UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50°C激活，95°C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR產物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開始前增加50°C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產物降解破壞，防止可能造成的污染。
普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入PCR試劑的過程中、正式PCR開始前就會完成少量PCR擴增，增加了背景，影響定量精度。而金牌Taq酶經過特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉，沒有活性；只有經過95°C
10 min的熱啟動以后，封閉被解除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。
6標準曲線、重復實驗和陰性、陽性對照
定量實驗，誤差是不可避免的。設立重復實驗，對數據進行統計處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上，嚴格的定量更應當重復6～8次，以滿足小樣本統計的要求。
如果作絕對定量，則標準曲線需要在5個點以上。標準曲線使用的標準品是
濃度已知的DNA樣本，可以自己制備，也可以購買商品化的試劑盒。其PCR反應條件應當與未知樣本的一致，以便在同一反應板上同時定量。
陰性對照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗PCR試劑和實驗操作上可能出現的問題。如果實驗中設立了IPC，則IPC既可以用來校正數據，也可以起到陽性對照的作用。
7 TaqMan探針技術原理
TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。
在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter,
R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,
Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號（圖4）。所以，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。
TaqMan探針根據其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqMan
MGB探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent
Quencher)，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove
Binder)修飾基團（圖5），可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設計。實驗證明，TaqMan
MGB探針對于富含A/T的模板可以區分得更為理想。
8
SYBR Green I熒光染料技術原理SYBR Green
I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料（圖6）。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR
Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBR
Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR
Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。
SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結果，對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。
9定量PCR儀簡介
目前在國內使用得比較多的熒光實時定量PCR儀有美國應用生物系統公司(Applied Biosystems，ABI)的7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的7000型為例作簡單介紹。
7000型熒光定量PCR儀設計滿足臨床檢驗、醫學研究和基礎實驗的要求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機配置的定量PCR引物和探針設計軟件Primer Express非常有用，因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設計定量PCR所需的TaqMan探針。
7000型有實時動態(Real-Time)和終點讀板(Plate
Read)兩種運行模式。實時動態模式用于定量，測定DNA或RNA拷貝數。7000型可以動態顯示PCR擴增曲線的生成，定量的線性范圍大于7個數量級，區分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達99.7%。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態性（SNP）分析等。當然，7000型也可以作為普通PCR儀使用。ABI已經發布12萬個商品化的定量PCR試劑盒，覆蓋人類全部4萬個基因，平均每個基因3個檢測試劑盒，為運用7000、7700、7900型開展課題研究創造了絕佳的條件。
7000型最大特色是具備多色檢測能力，熒光檢測的波長范圍為530～590
nm，能夠有效地分辨FAMTM / SYBR? Green I、VICTM /
JOETM、TAMRATM和ROXTM等熒光染料。多色熒光檢測技術為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內對照的陰/陽性分析提供了基礎。多重定量即在同一反應管內同時對多個目標基因進行定量，可以大大提高精度并節約成本。
7000型支持兩種定量化學：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴增反應是否特異，有無雜帶生成。
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