所謂Real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：
在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。
此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。
定量PCR儀的梯度功能：對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度（Tm值），但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出最適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程，簡化了摸索
PCR反應條件的繁瑣實驗，既節省實驗時間提高效率，又節省實驗成本。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。
為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-timeQ-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
