實時PCR實驗

PCR Super Mix-UDGROX 染料蒸餾水反向引物正向引物

ABIPRISM7700 型號系列檢測系統

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

以 50ul 反應體系為例。

Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG(Invitrogen11730-025)         25ul

ROX 染料（Invitrogen12223012)                                                       1ul

滅菌的蒸餾水（Gibco15230-162)                                                      12ul

10umol/L 反向引物                                                                              1ul
 
10umol/L 正向引物                                                                              1ul

小計                                                                                                     40ul

溶于 0.1XTE 或無菌水的模板                                                              10ul

總計                                                                                                     50ul

2. 專門的儀器

ABIPRISM7700 型號系列檢測系統。

二、方法

1.PCR 溫度循環程序

a. 三步循環法

50°C，保持 2 min(消化 UDG)。

95°C, 保持 2 min(使模板變性；使尿嘧啶 DNA 糖基化酶失活；使熱啟動：Taq 聚合酶活化）。

95°C，15s；55°C，30s；72°C，30s, 進行 45 個循環。

b. 二步循環法

50°C，保持 2 min(消化 UDG)。

95°C，保持 2 min(使模板變性；使尿嘧啶 DNA 糖基化酶失活；使熱啟動 Taq 聚合酶活化）

95°C，15s；60°C，30s，進行 45 個循環。

2. 解鏈曲線分析程序

a.PCR 反應的程序：40°C，1min；95°C，19 min；25°C，孵育 2 min。許多實時 PCR 儀器都配有相應的軟件，該軟件提供有熒光強度與解鏈溫度之間的導數關系曲線。

b. 考慮到反應體系中的離子環境，目的產物的 PCR 只有一個峰值，這才是理想的結果。如果擴增了不止一個產物和/或產生了引物二聚體，就會產生多個峰，當然引物二聚體的解鏈溫度通常比 PCR 目的產物低。所以，解鏈曲線分析可以迅速有效地、很好地控制定量 PCR 的進程。

c. 用 c-myc 特異 LUX 引物（表 15-1) 進行實時 PCR 的結果見圖 15-2[(a) 圖見封二彩圖]。進行實時定量 PCR 時，先把 c-myc 質粒從 10~10⁷ 拷貝的范圍內進行系列稀釋試劑按上面描述的體系進行混合，使用 SuperMix-UDG(2 卞反應混合物）。結果表明應用LUX 實驗平臺進行實時定量 PCR 可以進行 100 或更少拷貝的目的基因的擴增，并可以得到 7 個數量級的動態曲線。