實驗材料 ESI-MSMALDI - MS
試劑、試劑盒 提取緩沖液
儀器、耗材 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳
實驗步驟
眾所周知，在實驗室內和實驗室間難以保證雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳的重復性。在我們實驗室，強制性地要求嚴格遵守標準操作程序（sop
) , 以確保不同的操作者可以獲得可重復的分離結果。小麥白面粉樣品的 2D 膠圖譜示例如圖 16.1 所示。采用 Tris-CaCl2
提取法提取的并非“總蛋白”，而是小麥面粉中除谷蛋白之外的有代表性的蛋白樣品。如果提取總蛋白，由于谷蛋白的含量很高，可能會掩蓋掉其他較低豐度的蛋白質。同樣的問題也可能發生在其他含有高豐度蛋白的組織中，尤其是綠色組織中存在的二磷酸核酮糖竣化酶（Rubisco)
。
我們提供了三種方法。第一種是以使用 Tris-CaCl2 提取為特征的提取法，在我們實驗室被用于轉基因（GM ) 與非轉基因（non- GM ) 小麥的實質等同性的大規模蛋白質組學研究。第二種和第三種提取方法被廣泛用于文獻中，可適用于各種不同組織。
3.1 蛋白質提取
3.1.1 利用 Tris-CaCl2 緩沖液提取白面粉蛋白（參照 [ 11 ])
( 1 ) 2 g 白面粉加入 5 ml 預冷（4℃ ) 提取液，4℃ 攪拌 30 min。
( 2 ) 4℃，10000 g 離心 30 min，除去不溶物。
( 3 ) 保留上清于液氮中迅速冷凍，小份分裝，儲存于 -80℃，待用。
( 4 ) 用 Bradford 法測定蛋白質含量，以 BSA 作標準品。
3.1.2 酸 / 丙酮沉淀法提取白面粉或綠色組織蛋白（參照 [ 4 ] )
3.1.3 面粉
( 1 ) 在 50 ml Falcon 離心管中，懸浮 5 g 面粉于 20 ml 溶液 I 中，以最大速度渦旋 2 min，-20℃ 靜置 1 h。
( 2 ) 4℃，15000 g 離心 10 min。
( 3 ) 棄上清，加 5 ml 溶液II 渦旋以重懸沉淀。
( 4 ) 4℃，15000 g 離心 10 min。
( 5 ) 重復步驟 3、4 兩次。
( 6 ) 棄上清，在通風櫥中，連續氮氣流下干燥沉淀（確保無樣品損失）。
( 7 ) 用 1 ml pH 適宜的復水緩沖液重懸 40 mg 干燥樣品，渦旋 5 min，室溫 13000 g 離心 10 min。
( 8 ) 保留上清，小份分裝。在液氮中迅速冷凍。
( 9 ) 儲存于 -80℃。
( 10 ) 用前測定小份樣品的蛋白質濃度。
3.1.4 綠色組織
( 1 ) 使用預冷的研缽和研棒，液氮中研磨速凍的葉片。
( 2 ) 用 20 ml 溶液 I 懸浮 2 g 葉片粉末，以最大速度渦旋 2 min，-20℃ 沉淀 1 h。
( 3 ) 4℃，15000 g 離心 10 min，棄上清。
( 4 ) 加 5 ml 溶液II，渦旋重懸沉淀，4℃，15000 g 離心 10 min。
( 5 ) 重復步驟 4 兩次，在通風櫥中，連續氮氣流下干燥沉淀，確保無樣品損失。
( 6 ) 用 1 ml pH 適宜的復水緩沖液重懸 20 mg 干燥樣品。
( 7 ) 渦旋 5 min , 室溫 13000 g 離心 5 min。
( 8 ) 保留上清，小份分裝。液氮中迅速冷凍，儲存于 - 80℃ 備用。
( 9 ) 用前測定小份樣品的蛋白質濃度。
如提取的蛋白中有葉綠素污染，可嘗試 PEG/MgCl2 沉淀法（見注 3 ) 。
3.1.5 奧斯本分級分離法（ 參照 [ 12 ] )
( 1 ) 100 mg 面粉加 1 ml 水飽和正丁醇，室溫下攪拌 1 h。
( 2 ) 室溫下 5000 g 離心 10 min , 去上清。這是一個可選的步驟，用于“ 除脂”。
( 3 ) 抽提 “白蛋白/球蛋白” ：沉淀（來自步驟2 ) 加 1 ml 0.5 mol/L NaCl，室溫下攪拌 1 h。如上述步驟離心，保留上清并重復抽提。
( 4 ) 合并上清，采用 5%（V/V）乙酸在 4℃ 充分透析 48 h，期間至少更換 4 次透析液，每次 5 L。
( 5 ) 抽提 “醇溶蛋白”：沉淀（來自步驟3 ) 加 1 ml 70%（V/V）乙醇室溫攪拌 1 h。如前所述離心。保留上清并重復抽提。
( 6 ) 合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更換 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。
( 7 ) 抽提 “谷蛋白”：沉淀（來自步驟 5) 加 1 ml 50%（V/V）丙醇/2%（V/V）β-巰基乙醇/1%（V/V）乙酸，室溫攪拌 1 h ( 注意：如有需要，可直接用 DTT 代替 β-巰基乙醇）。如前所述離心，保留上清并重復抽提。合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更換 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。
( 8 ) 透析后，凍干所有溶液。
( 9 ) 最終的沉淀（來自步驟 7 ) 可用 1 ml “總蛋白提取緩沖液” （IEF 復水液）提取：室溫下混合抽提 1 h。如前所述離心，保留上清。分成小份，液氮中迅速冷凍，儲存于 -80°C 。