實驗材料 小麥
試劑、試劑盒 β-巰基乙醇氯仿異戊醇SSTE 緩沖液
儀器、耗材 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳
實驗步驟
3.1 芯片背景
我們使用了 19846 個點，包含 9246 個 Unigene 序列的小麥 cDNA 芯片（http://www . cerealsdb. uk. net/index. htm) 用于詳細的轉錄組研究 [3 ] 。重復的 unigene 集合陣列點到了 Codelink 活化芯片上（Amersham Biosciences Ltd, UK ) 。
芯片雜交用與 aa- dUTP- cDNA 樣品熒光標記染料反向的染料——Alexa 熒光染料 555 和 647。雜交在轉基因系 （B 102-1- 1、B1118-8-4 或 B1355-4-2 ) 和其原始非轉基因系 ( L 88-31 或 Cadenza ) 之間的兩個胚乳發育階段（開花后 14 天和 28 天，dpa ) 和葉片 ( 發芽后 8 天，dpg ) 成對比較 [5]。每個材料取樣 3 次，檢測 2 次。
cDNA 芯片的優勢是經濟實惠，并允許使用者完全控制內容和設計（定制芯片）。相反，Affymetrix 寡核苷酸芯片更加靈活，它是單染料系統，使試驗更簡單、更特異(提高對類似的異構體和多基因家族成員的識別能力），提供更量化和易比較的數據。GeneCMp 基因組芯片，采用了一套能匹配任何轉錄序列的 25 堿基寡核苷酸“探針”。以小麥芯片為例，每組探針有 11 個，多數與組裝的序列表達標簽（ EST ) 的公共保守域序列一致。因此，在 cDNA 芯片中，每一組探針對應的是許多 EST，而不是單個的 EST。為了識別不同的轉錄本，同時滿足其他條件，如 GC 含量相對一致，探針通過程序自動化設計。對于一個目標轉錄本，設計了 一個完全匹配的探針（perfect matches，PM ) 、一個單堿基錯配探針（mismatches，MM ) ，這樣能對非特異雜交有一個估計和矯正。然而，對于 MM 探針的真正信號值存在爭論，許多廣泛使用的分析方法不用 MM 探針（ 見 3.10節）。短 探針（ 如 25-mer) 對于序列相似的轉錄本更有效，因為單個堿基錯配足夠使雜交不穩定，而且固定長度使得雜交條件可以標準化，以滿足所有探針；相反，較長的可變長度的探針，比如那些 cDNA 芯片平臺使用的探針，將不可避免與任何與其部分序列相似性探針雜交，所以其真實信號集成了幾個不同的轉錄分子。
3.2 植物材料和生長條件
轉錄組比較研究使用了三個六倍體轉基因面包小麥的胚乳和葉片。轉基因小麥品系 B102 -1-1 ( L 88-31 背景） [ 6, 7 ]
和 B1118-8-4 ( Cadenz 北背景）[ 5 ] 由基因槍共轉化兩個質粒產生[ 14 ] 。一個質粒是 p1Axl 質粒 [ 13
] ，含有由自身的胚乳特異啟動子驅動的高分子質量谷蛋白亞基 1AX1 ( Glu-M ) 基因； 另一個質粒含有選擇基因bar 和標記基因
uidA，由玉米泛素啟動子驅動。轉基因系 B1355-4-2 [ 5 ] 也來自 Cadenza，共轉化獲得只含 IAX1 基因和 bar
基因編碼序列的“干凈”片段。一個常規育種系 L88-18 [ 9 ] 是 L88- 31 的姐妹系，也用于轉錄組比較。兩個常規育種系 ( L
88-31、L 88-18 ) 和轉基因系（B 102-1-1 ) 的轉錄組兩兩比較是：B 102-1-1與 L 88-31、L 88-18與 L
88-31、 B 102-1-1與 L 88-18。轉化方法的比較，即 “干凈”片段與整個質粒的比較：B1355-4-2 與
Cadenza、 B1118-8-4 與 Cadenza、 B1355-4-2 與
B1118-8-4。本研究所用的不同面包小麥攜帶的相關基因成分的詳細信息見表15 . 1 。
( 1 ) 植物種在平衡行列設計的盆缽中，每個處理（小麥生長發育階段）有 3 個生物學重復。
( 2 ) 開花后 14 天和 28 天胚乳，取樣的植物每盆種 2 株。每一株只保留 2 個分蘗。選中的盆缽（本試驗為 3 個生物學重復）包括用于發芽后第 8 天取葉片的第三株植物。
( 3 ) 每天觀察穗，一旦發現中央小穗開花就做標記。
( 4 ) 在無菌條件下，手工從穎果剝離種子胚乳；每盆只從 2 個穗子的中部分別取至少 24 枚胚乳為一個樣品。
( 5 ) 樣品都是一天中同一時間取樣，以避免晝夜節律的影響。
3.3 SDS-PAGE
通過谷粒總蛋白 SDS-PAGE 凝膠電泳，檢測所有小麥系的高分子質量亞基蛋白的表達（圖 15. 1 ) ，使用 10% ( m/V) 丙烯酰胺凝膠和 Tris-硼酸緩沖液系統 [ 10 ] 。