| 實驗步驟 | 3.1 芯片背景
我們使用了 19846 個點，包含 9246 個 Unigene 序列的小麥 cDNA 芯片（http://www . cerealsdb. uk. net/index. htm) 用于詳細的轉錄組研究 [3 ] 。重復的 unigene 集合陣列點到了 Codelink 活化芯片上（Amersham Biosciences Ltd, UK ) 。
芯片雜交用與 aa- dUTP- cDNA 樣品熒光標記染料反向的染料——Alexa 熒光染料 555 和 647。雜交在轉基因系 （B 102-1- 1、B1118-8-4 或 B1355-4-2 ) 和其原始非轉基因系 ( L 88-31 或 Cadenza ) 之間的兩個胚乳發育階段（開花后 14 天和 28 天，dpa ) 和葉片 ( 發芽后 8 天，dpg ) 成對比較 [5]。每個材料取樣 3 次，檢測 2 次。
cDNA 芯片的優勢是經濟實惠，并允許使用者完全控制內容和設計（定制芯片）。相反，Affymetrix 寡核苷酸芯片更加靈活，它是單染料系統，使試驗更簡單、更特異(提高對類似的異構體和多基因家族成員的識別能力），提供更量化和易比較的數據。GeneCMp 基因組芯片，采用了一套能匹配任何轉錄序列的 25 堿基寡核苷酸“探針”。以小麥芯片為例，每組探針有 11 個，多數與組裝的序列表達標簽（ EST ) 的公共保守域序列一致。因此，在 cDNA 芯片中，每一組探針對應的是許多 EST，而不是單個的 EST。為了識別不同的轉錄本，同時滿足其他條件，如 GC 含量相對一致，探針通過程序自動化設計。對于一個目標轉錄本，設計了 一個完全匹配的探針（perfect matches，PM ) 、一個單堿基錯配探針（mismatches，MM ) ，這樣能對非特異雜交有一個估計和矯正。然而，對于 MM 探針的真正信號值存在爭論，許多廣泛使用的分析方法不用 MM 探針（ 見 3.10節）。短 探針（ 如 25-mer) 對于序列相似的轉錄本更有效，因為單個堿基錯配足夠使雜交不穩定，而且固定長度使得雜交條件可以標準化，以滿足所有探針；相反，較長的可變長度的探針，比如那些 cDNA 芯片平臺使用的探針，將不可避免與任何與其部分序列相似性探針雜交，所以其真實信號集成了幾個不同的轉錄分子。
3.2 植物材料和生長條件
轉錄組比較研究使用了三個六倍體轉基因面包小麥的胚乳和葉片。轉基因小麥品系 B102 -1-1 ( L 88-31 背景） [ 6, 7 ] 和 B1118-8-4 ( Cadenz 北背景）[ 5 ] 由基因槍共轉化兩個質粒產生[ 14 ] 。一個質粒是 p1Axl 質粒 [ 13 ] ，含有由自身的胚乳特異啟動子驅動的高分子質量谷蛋白亞基 1AX1 ( Glu-M ) 基因； 另一個質粒含有選擇基因bar 和標記基因 uidA，由玉米泛素啟動子驅動。轉基因系 B1355-4-2 [ 5 ] 也來自 Cadenza，共轉化獲得只含 IAX1 基因和 bar 基因編碼序列的“干凈”片段。一個常規育種系 L88-18 [ 9 ] 是 L88- 31 的姐妹系，也用于轉錄組比較。兩個常規育種系 ( L 88-31、L 88-18 ) 和轉基因系（B 102-1-1 ) 的轉錄組兩兩比較是：B 102-1-1與 L 88-31、L 88-18與 L 88-31、 B 102-1-1與 L 88-18。轉化方法的比較，即 “干凈”片段與整個質粒的比較：B1355-4-2 與 Cadenza、 B1118-8-4 與 Cadenza、 B1355-4-2 與 B1118-8-4。本研究所用的不同面包小麥攜帶的相關基因成分的詳細信息見表15 . 1 。
( 1 ) 植物種在平衡行列設計的盆缽中，每個處理（小麥生長發育階段）有 3 個生物學重復。
( 2 ) 開花后 14 天和 28 天胚乳，取樣的植物每盆種 2 株。每一株只保留 2 個分蘗。選中的盆缽（本試驗為 3 個生物學重復）包括用于發芽后第 8 天取葉片的第三株植物。
( 3 ) 每天觀察穗，一旦發現中央小穗開花就做標記。
( 4 ) 在無菌條件下，手工從穎果剝離種子胚乳；每盆只從 2 個穗子的中部分別取至少 24 枚胚乳為一個樣品。
( 5 ) 樣品都是一天中同一時間取樣，以避免晝夜節律的影響。
3.3 SDS-PAGE
通過谷粒總蛋白 SDS-PAGE 凝膠電泳，檢測所有小麥系的高分子質量亞基蛋白的表達（圖 15. 1 ) ，使用 10% ( m/V) 丙烯酰胺凝膠和 Tris-硼酸緩沖液系統 [ 10 ] 。
3.4 RNA 提取
3.4.1 小麥胚乳總 RNA 提取
提取方法根據 Chang 等 [ 11 ] 改編而來。
( 1 ) 用預冷的研缽和杵（-70°C ) 在液氮里將 2~3 g 組織磨成粉末（見注 8 ) 。
( 2 ) 室溫下迅速將磨碎組織轉移到有 15 ml 提取緩沖液（加入 300 μl β-巰基乙醇 ) 的離心管中，充分顛倒混勻（ 見注9) 。
( 3 ) 用等體積氯仿：異戊醇（終體積 15 ml ) 抽提兩次，液相分離用 15000 g 室溫離心 10 min。
( 4 ) 上清液加 0.25 倍體積 10 moI/L LiCl 混勻。4℃ 過夜沉淀 RNA，4℃、15000 g，離心 20 min 獲取 RNA。
( 5 ) 500 ml SSTE 懸浮沉淀顆粒。
( 6 ) 用等體積氯仿：異戊醇抽提一次。
( 7 ) 上清液加兩倍體積乙醇，-70℃ 沉淀 30 min 以上或者 -20℃ 沉淀 2 h。
( 8 ) 15000 g 離心 20 min 沉淀 RNA。
( 9 ) 75% 乙醇洗滌。
( 10 ) 干燥沉淀并溶解于無核酸降解酶水中。
3.4.2 發芽后 8 天幼苗 RNA 提取
提取方法根據 Cheng 等 [ 12 ] 改編而來。
( 1 ) 用預冷的研缽和杵（-70℃ ) 加液氮里將已知質量組織（大約 1 g 幼葉）磨成粉末（見注9) 。
( 2 ) 將冷凍的粉末快速轉移到第二個有 10~15 ml 勻漿緩沖液的研缽中（見注10)，繼續研磨至均勻（見注 11)。
( 3 ) 勻漿液轉移到 50 ml 帶帽的圓底旋蓋離心管中，60℃ 孵育 10 min ( 勻漿液終體積 5~10 ml )。
( 4 ) 離心管置冰上冷卻，加 0.2 倍體積 pH 5.5 的 5 mol/L 乙酸鉀（見注 12) ，輕輕地充分混勻，然后冰上靜置 10~15 min。
( 5 ) 10000 g、4℃ 離心 15 min , 取上清液到新的離心管中。
( 6 ) 加等體積酚：氯仿（1 : 1，V/V ) 混勻，擰緊瓶蓋并劇烈振蕩 10 min。10000 g、21°C 離心 10 min。取上層水相于新離心管中（見注13)。
( 7 ) 水相重復上一步的酚：氯仿萃取和分層。
( 8 ) 往水相加 0~1 倍體積 3 mol/L pH 5.3 乙酸鈉和 2.5 倍體積乙醇。混勻后 -20℃ 孵育過夜以提高核酸沉淀效率。
( 9 ) 10000 g 、4℃ 離心 30 min 沉淀核酸，棄上清。倒置離心管數分鐘。
( 10 ) 少量無核酸降解酶水（ 300~700 μl ) 溶解沉淀。核酸溶液轉移到 Eppendorf 管，加 0.67 倍體積 10 mol/L 氯化鋰沉淀 RNA。拌勻，冰上孵育 20~30 min ( 見注14)。
( 11 ) 離心（15000 g，室溫，20 min ) 沉淀 RNA，棄上清。
( 12 ) 用盡可能小體積（ 200~300 μl) 的無核酸酶水溶解沉淀，重復氯化鋰沉淀，和上一步同樣離心沉淀 RNA。
(13 ) 200 μl 無核酸酶水溶解沉淀，加入 15 μl 5 mol/L 乙酸鉀（pH 5.5 ) 和 800 μl 乙醇。混勻，離心（15000 g 室溫，20 min) 沉淀 RNA ( 見注15)。
( 14 ) 棄上清，加入 1.0 ml 80% ( V/V ) 乙醇，離心洗滌 RNA ( 15000 g，室溫，10 min)。
( 15 ) 離心管開蓋置于超凈工作臺，室溫干燥沉淀不超過 10 min。溶解于 100~200 μl 無核酸酶水中。將每份樣品分成等量小份以避免在反復凍融過程中污染或者降解。
3.4.3 總 RNA 樣品除去基因組 DNA
RNA 提取之后用 DNA-free ( DNA 酶處理和清除試劑盒，Ambion) 按照使用說明處理 RNA 片段。該系統專為去除 RNA 樣品中的 DNA 雜質和清除處理后的 DNA 降解酶 I，無需加熱或苯酚提取。
3.4.4 RNA 定量分析和質量控制
RNA 濃度、完整性及質量檢測使用 Nanodrop ND 1000 分光光度計（Labtech Int ,U K ) 和 Agilent 2100 生物分析儀 ( RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies, PaloAlto, CA，USA ) ( 見注 16)。
3.4.5 樣品保存
RNA 樣品短期（最長 3 個月）保存在 -20℃，長期則在 -80℃。
3.5 cDNA 合成
( 1 ) 加 100 μg DNA 酶處理過的總 RNA ( 不超過 20 μl) 、8 μl oligo (dT)23 錨定引物和無核酸酶水至終體積 28 μl。
( 2 ) 將啟動反應混合物在 70℃ 孵育 10 min，置于冰上 5 min。
( 3 ) 向啟動反應混合物加入 cDNA 合成反應混合物：10 μl 5x 第一鏈緩沖液，10 μl 0.1 mol/L DTT，5 μl 50x aa-dNTP 混合物，2 μl Superscript 逆轉錄酶Ⅲ（ 200 U/L ) ，加無核酸酶水至終體積 50 μl。
( 4 ) 42℃ 孵育 2~3 h。
( 5 ) 用微型離心柱（Qiagen) 參照使用說明純化 aa-dUTP-dDNA 產物。
( 6 ) 收集最后的洗脫液 10 μl 作為樣品。cDNA 的產品將用于準備芯片雜交的探針和實時 RT- PCR 技術。最后反應可不用 50x aa-dNTP 混合物進行（見注 17)。
3.6 cDNA 芯片標記
( 1 ) 為了 cDNA 與突光染料偶聯反應，將需要反向染料標記的總 cDNA ( 見第3.5節步驟6 ) 分成兩等份（5 μl ) ，并將不同梁料的反應放在單獨的管。
( 2 ) 每管加入： 5 μl 氨基烯丙基純化的 cDNA ( 見 3 . 5 節步驟 3 ) ，3 μl 1 mol/L NaHCO3 標記緩沖液，2 μl ALexa 熒光染料 555 或者 647，10 ml 無核酸酶水。
( 3 ) 移液器混勻，室溫黑暗孵育 1 h。
( 4 ) 用 mini Elute columns 試劑盒（Qiagen) 去除沒有與 aa-dUTP- cDNA 偶聯的染料( 見注18)。
3.7 cDNA 芯片雜交
( 1 ) 取 20 μl 混合的標記 cDNA ( 來自 3. 6 節步驟 6 的兩個 Alexa 染料）加入到 25 μl 2x 雜交緩沖液和 2 ml poly (dA ) 。
( 2 ) 探針在 95℃ 3 min 變性。
( 3 ) 標記的探針涂在蓋片上，并將載片印有 Code Link 面朝下放置。
( 4 ) 將芯片雜交盒置于烘箱內 42℃ 過夜。
( 5 ) 將芯片置于含有溶液 A 的 Falcon 管（藍帽）中（見 2. 6 節步驟 2 ) ，室溫顛倒 15 min (見注 19)。
( 6 ) 將芯片轉移到第二個含有溶液 A 的 Falcon 管中，室溫顛倒 15 min。
( 7 ) 將芯片轉移到第三個含有溶液 B 的 Falcon 管中（ 見 2 . 6 節步驟3 ) ，室溫顛倒 15 min。
( 8 ) 將芯片轉移到第四個含有溶液 C 的 Falcon 管中（見 2 . 6 節步驟3 ) ，室溫顛倒 15 min。
( 9 ) 將芯片放置干燥的 Falcon 管中，立刻 8000 g 離心干燥。
( 10 ) 用 Axon 儀器公司的 Gene-Pix 400B 型雙激光掃描儀掃描雜交芯片。
3.8 cDNA 芯片數據分析
芯片做圖像分析，檢測每一個觀測點的兩種熒光信號的強度，以此來評估成對小麥系之間轉錄基因的表達差異。數據標準化后，作適合某個模型的統計分析，說明實驗設計 ，檢測差異表達的顯著性。
3.8.1 圖像分析和標準化
芯片上的點用 GenePix 軟件掃描成圖像（Gene Pix 第 5 版，美國 Axon 儀器公司），然后所有的點進行人工檢測，排除雜交失敗或者信號弱的。圖像分析給出了每一點的所有像素，這些數據包含了兩種熒光染料信號（647和 555 ) 的平均值和 Log2 比率值。這些數據專用于差異表達分析。將數據從 GenePix 導入 GeneSpring 軟件包 （GeneSpring 6. 2 美國硅遺傳公司），然后信號強度的 Log2 比率值進行標準化。本研究中，一個點的 Log2 比率值（差異表達的）（ M ) 和 Log2 乘積（亮度的）（ A ) 之間的比較表明，局部加權光滑描點技術（ LOWESS ) 標準化處理，可用于消除數據不佳的趨勢。換句話說,所有點的 Log2 比率值乘以 （ across ) 光 強 （ Log 乘積）應該在一個恒定范圍內，但圖像顯示有一些會隨著 A 増加而發生變化的趨勢。因此，標準化處理的目的是消除 Log2 比率數據的系統變異（ 比如由于實驗過程）。局部加權光滑描點技術（ LOWESS ) 標準化處理，是通過逐點檢測 M 和 A 值之間的關系，然后相應地調整 M 值（adjusted M = MLOWESS- fittedM) 。由于有兩個獨立的實驗， L 88-31、 L 88-18和 B 102-1-1的數據與 Cadenza的數據分開處理。
3.8.2 統計分析
參考 Kerr [ 15 ] 討論的方法，使用 GenStat 統計系統（ GenStat 第 7 版 ，GenStatProcedure Library Release PL15， Lawes Agricultural Trust, Rothamsted Research Harpenden, U K ) 分析規范化的數據（ 進一步的詳細信息見[ 5 ] 及其補充材料）。在估計基因的固定效應之前，用符合 Log2 比率的線性混合模型來估算實驗設計（ 生物學和技術重復）的隨機效應。該模型通過模型計算用數據的整體殘差（ 噪聲）估計標準誤參 數（一個基因一個參數）。每個參數對其標準誤的比率服從殘留自由度的 t 統計分布，這使得從 0 (Log2 范圍）開始的差異表達統計上顯著性得到評估。在我們的研究中，通過表達量和拷貝數篩選顯著差異表達基因（ P <0.05 )，只有那些表達差異大于 1.5 倍并且存在多 2 次以上重復的基因被保留下來做進一步分析。
3.8.3 用實時 RT-qPCR 驗證差異表達
挑選轉錄本做實時 RT- qPCR 驗證芯片表達數據，見 3.13 節。
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