實驗方法丨蛋白質體外瓜氨酸化

組蛋白的翻譯后修飾過程對 DNA 轉錄，染色體功能以及維護細胞信號傳導通路的正常運行具有重要的作用，瓜氨酸化是由稱為蛋白質精氨酸脫亞胺酶（Protein Arginine Deiminases，PADs）的酶家族催化的許多關鍵組蛋白修飾手段之一。PADs 催化肽基精氨酸水解，在組蛋白上形成肽基瓜氨酸，調節與染色質結構相關的許多生化過程。

PAD 家族由鈣依賴性同工酶 PAD1, 2, 3, 4 和 6 的五個成員組成。組蛋白瓜氨酸化是通過在組蛋白上轉化精氨酸而影響染色體結構，導致氫鍵的減少和染色質解聚。很多重大研究已經將 PAD 確定為與癌癥，自身免疫性疾病（類風濕性關節炎）和炎性疾病等許多人類疾病相關的藥物發現項目的重要靶位。

實驗材料

• PAD Cocktail, Active（#P312-37C ): 10μl Active  PAD Cocktail (包含 5 μg 總 PAD 蛋白）用 20ul PAD cocktail 稀釋緩沖液進行稀釋；

• 抗-GST 抗體交聯的 Agarose Beads: 可購買商品化產品或實驗室自制；

• PAD cocktail 稀釋緩沖液：推薦配方為 0.1M tris-Cl, PH 7.4, 0.25 mM DTT, 10 mM CaCl2；

• PAD 緩沖液：推薦配方為 0.1M tris-Cl, PH 7.4, 5 mM DTT, 10 mM CaCl2, 10 μg/μl aprotonin,  10 μg/μl  leupeptin, 10 μg/μl pepstatin；

• 4×Laemelli 樣品緩沖液：推薦配方為 8% SDS，40% Glycerol，250 mM tris-Cl, PH 6.8，0.02% Bromophenol Blue, 8% β-mercaptoethanol；

• 底物蛋白：根據各實驗室的研究目的。

實驗步驟

1. 用 PAD cocktail 稀釋緩沖液清洗和平衡 5μl 抗-GST 抗體交聯的 Agarose Beads；

2. 混合平衡后的 5μl 抗-GST 抗體交聯的 Agarose Beads 和稀釋好的共 30μl PAD Cocktail，在 4°C 孵育一個小時，并進行搖晃；

3. 陰性對照，僅含有 PAD cocktail 稀釋緩沖液；

4. 孵育以后 Agarose Beads 用 PAD 緩沖液進行清洗；

5. 清洗以后加入 10μl 底物蛋白和 100μl PAD 緩沖液，在 37°C 孵育 2 個小時，并進行搖晃；

6. 離心，獲取上清，上清中含有被瓜氨酸化的目的蛋白；

7. 用 25μl  4×Laemelli 樣品緩沖液終止反應；并將樣品純存于-80°C 以備進一步深入研究。