密度梯度離心基礎知識（一）

一、概論
在密度梯度離心中，單一樣品組份的分離是借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達到的。梯度液的密度隨著離心半徑的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在離心過程中自形成，密度梯度可以分為：速率—區帶（Rate-Zonal）離心和等密度（Isopycnic）離心。
在速率—區帶離心中混合樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份“顆粒”在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時刻形成了數個含有單一組份顆粒的“區帶”。離心過程中在最“重”的樣品（或者說沉降得最快的樣品）形成沉淀前就停止了。樣品在離心后與梯度液一起收集，用常規技術去除梯度材料后就得了某個較純的成份。每個單一組份的沉降速率取決于它們的形狀、尺寸、密度、離心力的大小、梯度液的密度和粘性系數。
對于相類似的生物體組份常常形狀也相似。在速率—區帶離心中我們常常使梯度液的最大密度不超過在該梯度中的浮密度。利用這類生物體組份在尺寸上的差異而形成的沉降速率的不同，選擇某一特定時刻，當它們中的各個純樣品區帶之間的距離拉得最遠時停止離心即可以達到分離目的。
與速率—區帶離心法不同的是，等密度離心是依賴于樣品顆粒的不同密度來進行離心分離的。混合樣品可以鋪在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一種方法依靠離心力來形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的過程中由于樣品各單一成份向它們自己的等密度區靠攏即達到了分離純化的目的。對于速率—區帶離心，梯度液最大密度一般小于樣品中各組份的密度，也就是說是在樣品正在沉降過程中的不是在形成沉淀后來分離樣品；而等密度離心法中，梯度液的初始最大密度常常超過樣品各組份的密度，利用每個單一組份沉降或上浮到它們各自的等密度區來達到分離的目的。
密度梯度離心法的理論基礎是（參考文獻 1）
每種純樣品成份在梯度液中的沉降速度可以表達為：

式中：v是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）
         d：樣品顆粒的直徑（厘米），我們在初步計算時就假設樣品顆粒為球體。非球形顆粒樣品，可以以上式為基礎進行修正。
         σ：樣品顆粒的密度（克/厘米³）
         ρ：密度梯度液的密度（克/厘米³）
         η：密度梯度液的粘性系數（克/厘米?秒）
         ω：離心機主軸的旋轉角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：轉/分
         r：顆粒所在位置與旋轉軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）
當：σ>ρ時，v>0即樣品順離心力方向沉降
      σ<ρ時，v<0即樣品逆離心力方向上浮
      σ=ρ時，v=0即樣品停止沉降或上浮，“穩定”在這一位置
用這個公式可以很好地解釋在速率—區帶離心法或等密度離心法中單一樣品的沉降（或上浮）行為。

二、轉頭的選擇：

1、離心轉頭分類：

其他特種轉頭：分析轉頭、土壤脫水轉頭、細胞浮選轉頭、管式轉頭、血球比測定轉頭、細胞淘洗轉頭等等。

2、各種轉頭用于密度梯度離心的比較：
（1）各種轉頭用于速率—區帶（R-Z）離心的優缺點分析：
A、固定角式轉頭：壁部效應影響很大，用于 R-Z離心回收率低，純度也受影響一般只用于差分離心和等密度離心，離心時間較短。是各類離心機的最高速轉頭。
B、甩平轉頭：細長離心管用于 R-Z離心可以獲得較高純度和高分辨率，且容易控制離心時間，壁部效應很小。25,000rpm~30,000rpm的甩平轉頭最適用于亞細胞器的離心分離，而 40,000~42,000rpm的甩平轉頭適用于核酸、蛋白、病毒等類物質的分離。離心時間較長。
C、垂直管轉頭：沉降距離最短，因而離心分離時間也最短。最大半徑前幾乎沒有壁部放位，最大半徑后有一定壁部效位，垂直剖面積較大，因而離心后純樣品區帶的容量也較大。但在有沉淀的密度梯度離心中，沉淀和浮動區帶方向轉換之間存在干擾，可能影響純樣品區帶的純度。大部分 R-Z離心沒有沉淀，垂直管轉頭很適合做R-Z離心。
D、近垂直轉頭：管軸線與旋轉主軸之間傾角7度~9度（角式轉頭20度~45度）沉降距離比垂直轉頭稍大，離心時間比角式、甩平轉頭都要短。由于有了傾角，沉淀可沿管壁滑向底部，因此基本上消除了沉淀與浮動區帶轉換之間的干擾，適合做R-Z離心，特別適合做生物大分子（如質粒DNA）的自形成梯度等密度離心。
E、區帶轉頭：沒有壁部效應特別適合做大容量的病毒、亞細胞器、生物大分子的R-Z離心，可用于研究、中試和小批量生產。分離純度高，量大，但操作要求高，轉頭及附件價格昂貴。
F、連續流離心轉頭：工作原理與區帶轉頭相似，可連續工作，分離量大，分離純度高，可用于各種生物體的差分、R-Z及等密度離心。近年來高速連續流轉頭常用于大量發酵液（大腸桿菌、細胞）菌體的沉淀。