密度梯度離心基礎知識（四）

從上面公式可以看出，要使曲線變陡：
a：降低β°
b：提高轉速
c：加大離心半徑
d：增大初始密度
以同等轉速離心，甩平轉頭的 r較大，在同等初始密度條件下，甩平轉頭的密度梯度曲線比垂直管轉頭、近垂直轉頭或固定角式轉頭都要陡一些。（參見下圖）

CSCL初始密度為 1.72g/cm3時的自形成梯度曲線

九十年代以前生物大分子離心分離實驗多數是利用甩平轉頭，轉速在60,000rpm以下，某些實驗一次要離心數十小時，使用的CSCL也較多（分析純，價格高，且不能反復使用）離心分離成本昂貴（如80年代初期，質粒DNA分離，CSCL初使密度為1.71g/cm³，33,000rpm， 20℃甩平轉頭離心72小時，一次離心就用去了驅動部1.4億轉的壽命，而當時的超速離心機驅動部的保用壽命才100億轉，雖然由于CSCL在離心后梯度曲線較陡而獲得了很純的質粒 DNA和染色體 DNA，但成本實在是太高了）。九十年代開始使用近垂直管（或稱小角度）轉頭，在 CSCL梯度中加入 E.B.和 Triton x-100，初始密度 1.55g/cm³、78,000rpm，20℃離心4小時（用去驅動部壽命0.187億轉）或用垂直管轉頭，同樣的梯度 100,000rpm，20℃2小時（用去驅動部壽命0.12億轉都獲得了滿意的結果。（文獻 5）
●梯度的密度范圍：
在不同距離處（r₂，r₁）密度差可以用下面公式表示：
從上式可以看出（ρ₂-ρ₁）值不僅和轉速的平方而且和距離的平方差成正比。
●轉頭選擇對梯度曲線斜率與梯度范圍時影響：從前面的曲線圖可以看出對不同轉頭，梯度曲線的差異：水平轉頭離心時和復原（離心完成）后對于梯度來說，離心管中液面至管底距離保持不變。對固定角式，小角度轉頭及垂直管轉頭，離心頭沉降距離很短，而在離心后復原時這項距離明顯拉長了，也就是說梯度曲線變得平緩了，這種距離的延伸有利于離心分辨率的提高。因此垂直管轉頭比NVT（近垂直管）轉頭，NVT轉頭比角式轉頭的距離延伸更大，分辨率也就更高。但與此相反，純樣品帶的寬度都是甩平轉頭最窄，垂直管轉頭最寬。
●梯度中的最大和最小密度：
計算前，首先要找到等密度點的位置。
等密度點：離心后密度與離心開始時初始密度相等的點。
對于甩平轉頭：設等密度點為 rc

式中：r_t梯度表面與旋轉中心距離
         r_b離心管底與旋轉中心距離
該公式可用于估算離心結束時（轉頭剛開始減速時）角式轉頭及垂直管轉頭的 rc位置。設梯度液初始密度（均勻）為ρ i，在求得 r_c后梯度中最大密度與最小密度可用下式計算：

如果已經設計好密度變化范圍就可以計算所需要的離心轉速：

 
●計算實例：
DNA分離，CSCL梯度，初始密度 1.70g/cm³，根據離心要求，理想的最大密度為ρ_b=1.75g/cm³，最小密度為ρ_t=1.65g/cm³
用某甩平轉頭最高轉速55,000rpm，r_b=12cm，r_t=6.7cm則 N=45,500rpm，
校核：由于密度＞1.2 g/cm³按規定這個轉頭的最高轉速不能超過：

46,200rpm＞45,500rpm所以設計成立。
●離心時間計算：
計算例題中離心所需要的時間：
已知 r平均=9.35cm，樣品 S_20.w=15

●討論必須注意不能使 CSCL在離心管底部最大密度超過 1.9 g/cm³， 20℃，否則CSCL將可能析出結晶，而CSCL的結晶密度為4 g/cm³，很可能在結晶的局部損壞塑料離心管，從而造成CSCL泄漏而進一步腐蝕轉頭，（特別是鋁合金轉頭）而造成轉頭在離心中炸裂的嚴重事故。為安全起見，重金屬的梯度實驗不要在鋁合金轉頭或甩平轉頭中的鋁合金吊桶中做。
（4）預形成梯度
●不連續（階梯型）梯度：
分層鋪設不連續梯度，樣品鋪在梯度液之上，離心時不同組份越過小于本身浮密度時梯度層次而最后到達密度大于樣品浮密度的梯度界面之前形成純樣品區帶。一般設置三至五個層次。
●連續梯度：
根據被分離樣品的性質設計線性、凸指數、凹指數或凹凸復合指數曲線梯度。樣品一般鋪在梯度液上部離心分離，要注意的是某些梯度材料（如重金屬鹽）預形成梯度在離心過程中由于離心力和濃度擴散的復合作用而可能改變形狀。我們也可以用離心來制備預形成梯度，如果形成的梯度曲線（近直線型）中點的密度和初始密度相同則梯度的穩定時間（對 CSCL）
T=0.3 (r_b ?r_t )² （小時）
當然這是用于估計形成不同 CSCL梯度曲線所需要的時間的經驗公式。它可用以實際離心操作。
（5）為了使實驗人員對不同生物體在不同梯度材料中的浮密度有初步認識，下列圖供參考圖中：
a.在水或在 0.25M蔗糖液中的推定浮密度
b.在等密度蔗糖液中推定浮密度
c.在等密度 CS2SO4中推定浮密度
d.在等密度 CSCL中推定浮密度