試劑、試劑盒 寡核苷酸雜交液寡核苷酸預雜交液SSC 或 SSPETEAC1 洗滌液TMAC1或 TEAClTMAC1 洗滌液核酸和寡核苷酸放射性標記的寡核苷酸探針
儀器、耗材 雜交裝置振蕩培養器
實驗步驟
材料
溶液和緩沖液
稀釋貯存液至適當濃度。
寡核苷酸雜交液
6XSSC(或 6XSSPE)
0.05mol/L 磷酸鈉（pH6.8)
1 mmol/LEDTA（pH8.0)
5XDenhardt’s 液
100ug/ml 變性、斷裂的鮭精 DNA(Pharmacia 公司或按第 6 章的方案 10 所述制備)
100 mg/ml 硫酸右族糖酐（見箄 16 章信息欄 DEAE-右旋糖酐）
寡核苷酸預雜交液
6XSSC(或 6XSSPE)
0.05mol/L 磷酸鈉（pH6.8)
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5XDenhandt’s 溶液
100ug/ml 變性、斷裂的鮭精 DNA(Pharmacia 公司或按第 6 章的方案 10 所述制備)
6xSSC 或 SSPE
在本方案步驟 4、5 之前，將此液放置于冰上。
TEAC1 洗滌液
2.4mol/LTEACl
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.2 mmol/LEDTA(pH7.6)
1 mg/mlSDS
該洗滌液用于長度為 50~200 個核苷酸的探針。使用前須預溫至所需溫度（見步驟 6、7)。
TMAC1(5mol/L) 或 TEACl(3mol/L)
配制 5mol/LTMAC1 或 3mol/LTEAC1 水溶液。TMACl 用于長度為 14~50 個核苷酸的探針，而 TEACl 則用于長度為 50~200 個核苷酸的探針。這二種試劑均可從 Aldrih 公司購買。在 TMAC1 和 TEAC1 溶液中，加入終濃度約為 10% 的活性炭，度摔 20~30 分鐘。活性炭沉陣下來后，用 Whatman1 號通紙過濾季銨鹽溶液，并用硝酸纖維素濾膜（0.45um 孔徑) 過濾除菌。測量溶液的折光指數，用下列公式精確計算季銨鹽溶液濃度：C=（n-1.331）/0.018, 式中 C 是季銨鹽溶液摩爾濃度，n 是折光指數。過濾的溶液可在室溫下保存于棕色瓶中。
TMAC1 洗滌液
3.0mol/LTMAC1
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.2 mmol/LEDTA(pH7.6)
1 mg/mlSDS
該洗滌液用于長度為 14-50 個核苷酸探針使用，使用前須預溫到所需溫度（見步驟 6、7）。
核酸和寡核苷酸
固定于硝酸纖維素、尼龍濾膜或其他濾膜的目的靶核酸（Southern 或 Norths 印跡、裂解的細菌克隆成噬菌體噬斑的濾膜）
探針
放射性標記的寡核苷酸探針
按方案 2 或方案 7 所述制備探針。我們推薦使用磷酸化探針，雜交前按方案 4 所述用 CPB 沉淀法純化探針。這種純化方法可以除去未摻入的 [γ-32P]ATP, 從而減少放射性自顯影時易與陽性雜文信號混淆的強放射性斑點（胡椒粉斑點）的數量。
專用設備
雜交裝置（請見步驟 1)
振蕩培養器、水浴或雜交裝置預溫至 37°C(步驟 1 和步驟 3)，洗滌時調至適當的洗滌溫度（步驟 7)。
方法
1. 濾器或膜在寡核苷酸預雜交液中 37°C 下預雜交 4~16 h。
圓形濾膜的預雜交、雜交與洗滌最好在 Sears Seal-A-Meal 袋或帶有密封蓋的塑科盒中進行，Southern 與 Northern 雜交膜可在有密封蓋的玻璃管中進行。
2. 去預雜交液，置換成含 180pmol/L 的放射性標記的寡核苷酸探針的雜交液。
當數種寡核苷酸同時雜交時，每一種探針的濃度都應在 180pmol/L, 放射性標記探針的比活度應在 5X105 至 1.5X106cpm/pmol 之間。
3. 濾膜在 37°C 下溫育反應 12~16 h。
4. 將放射性的雜交液棄至適當的容器內，在 4°C 下用預冷的 6XSSC 或 6XSSPE 洗滌濾膜三次，以洗去大部分硫酸右旋糖酐。
5. 在 4°C 下用預冷的 6XSSC 或 6XSSPE 洗滌濾膜兩次，共 30 min。
6. 在 37°C 下用 TMAC1 或 TEAC1 液洗滌濾膜二次。
此步驟的目的是用季銨鹽溶液置換 SSC 或 SSPE, 只有認真操作方可見季銨鹽溶液的優越性。
7. 在低于圖 10-2 指示的 Tm 值 2~4°C 的溫度下，用 TMAC1 或 TEAC1 洗滌液洗滌濾膜二次，每次 20 min。
雜交體在含 TEAC1 的緩沖液中的 Tm 值比在含 TMACl 的緩沖液中低 33°C 確保緩沖液中預溫至所需溫度，且溫度波動小于±1°C。
8. 從洗滌液中取出濾膜，室溫下吸干液體，按附錄 9 所述進行放射自顯影。