通過乳膠珠沿微管的移動來觀察基于微管的運動蛋白活性
通過微管滑行來觀察基于微管的運動蛋白活性
| 實驗材料 | 微管 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 聚賴氨酸溶液 |
| 儀器、耗材 | 蓋玻片 |
| 實驗步驟 | 1. 準備該顯微檢測所需的蓋玻片： (1) 蓋玻片在 200 μg/ml 聚賴氨酸溶液中室溫過夜。 (2) 玻片在盛有 15 ml 蒸餾水的培養皿中翻轉洗滌 4 次，每次 10 分鐘。 (3) 洗過的蓋玻片風干并存放在無灰塵的容器中直到使用。 2. 用含 1 mmol/L 的 PME 緩沖液 300 倍稀釋羧基化了的乳膠珠，得到 2.5% 的懸浮液。 3. 在含 2 mmol/L ATP 的 PME 緩沖液中混合稀釋了的珠子和含運動蛋白的微管相關蛋白溶液（或純化的蛋白本身)。1 倍體積的珠子比 4 倍體積的蛋白溶液。在 4℃ 至少冷浴 5 分鐘，使蛋白結合到珠子上。 4. 在小離心機上沉降珠子加以收集，用新鮮緩沖液重新懸浮。 5. 從冰箱拿出一份不含微管相關蛋白的用紫杉醇穩定的微管，可以是通過鹽抽提紫杉醇穩定的微管或通過紫杉醇誘導組裝磷酸纖維素純化的微管蛋白二聚體而制備的。這些微管以 1:3 的比例（微管:珠子，體積:體積）加到包被/蛋白的珠子上。 6. 5 μl 珠子溶液和微管加到包被有聚賴氨酸的蓋玻片上。翻轉到一塊顯微鏡載玻片上并用圖像增強了的微分干涉相差顯微鏡觀察。聚焦到在包被有聚賴氨酸的蓋玻片上不動的微管，觀察珠子結合微管并沿著微管轉運。 |
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