實驗步驟：
（1）誘導靶蛋白表達
分別挑取對照菌和重組菌1~2個菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養過夜。
取5ml過夜培養物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養2h以上，至對數中期（A550=0.5~1.0）。
向誘導管中加入IPTG使其濃度達到1mmol/L，28℃振蕩培養5h左右取樣。
（2）目的蛋白質的分離純化
樣品處理
① 取500ml誘導的培養液，12000rpm離心5min，棄上清，收集菌體。菌體在-20℃（最好在用液氮或干冰）反復凍融幾次，使菌體裂解后呈現黏液狀。
② 用針筒將20ml含0.2% Triton X-100和1mmol/L
PMSF的PBS強行注入黏的細胞裂解液中，劇烈混勻。加入DNase和RNase至終濃度達5μg/ml，4℃振蕩溫育10min，4℃
8000RPM離心出去不溶物，上清液轉移至一新管中，加β-巰基乙醇（或DTT）至終濃度為1mmol/L。
上清液需用0.45μm濾膜過濾，以防止堵塞柱子。Triton X-100可防止蛋白聚集，DTT或β-巰基乙醇可使GST保持還原狀態。
蛋白純化
① 在注射器（或恒流泵的導管）中充滿結合緩沖液，排除氣泡。打開親和柱出口，連接注射器和柱子，以10個柱床體積的結合緩沖液（PBS）平衡柱子，流速控制在1ml/min。
② 用注射器上樣，流速控制在0.2～1ml/min，上樣量約為2個柱床體積。
③ 用5～10個柱床體積的PBS洗脫未結合蛋白，流速1ml/min（或檢測沒有蛋白流出為止）。
④ 用2個柱床體積的洗脫緩沖液目的蛋白，流速1ml/min，在洗脫流出液達到0.5ml后開始收集目的蛋白。
⑤ 結合力低的柱子可用2個柱床體積2M的鹽酸胍洗柱子后，立即用5個柱床體積的結合緩沖液洗柱子，以達到再生的目的。
⑥柱子儲存在4℃下的20％乙醇中。
Western Blotting
實驗目的：掌握Western Blotting的操作流程和通過Western Blotting鑒定目的蛋白的方法
實驗原理：
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量.其分離原理是根據蛋白質的分子量的差異，因為SDS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT)，其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構，SDS
是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級及三級結構，并與蛋白質的疏水部分相結合，破壞其折疊結構，電泳樣品假如樣品緩沖液后，要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質復合物，SDS-蛋白質復合物在強還原劑巰基乙醇存在時，蛋白質分子內的二硫鍵被打開而不被氧化，蛋白質也完全變性和解聚，并形成榛狀結構，穩定的存在于均一的溶液中，SDS與蛋白質結合后使SDS-蛋白質復合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子，這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋，遠遠超過其原來所帶的電荷，從而使蛋白質原來所帶的電荷可以忽略不計，消除了不同分子之間原有的電荷差別，其電泳遷移率主要取決于亞基分子質量的大小，這樣分離出的譜帶也為蛋白質的亞基，然后根據抗原－抗體結合原理及顯影技術就可以確定表達的蛋白是否為目的蛋白
實驗步驟：
(1) 電泳
① 準備步驟
將凝膠板水洗滌干凈，然后使其自然風干或烘干。梳子臨用前用無水乙醇擦拭，讓其揮發至干。安裝玻璃板、板條，并將玻璃板固定在灌膠架上。
按下表配制適合濃度的分離膠，搖勻后迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，小心在膠上覆蓋一層95%的乙醇。
| 10%(ml) | |
| H2O | 4.10 |
| 29%Acr+1%Bis | 3.34 |
| 4×分離膠緩沖液(pH8.8) | 2.50 |
| 10% SDS | 0.05 |
| TEMED | 0.02 |
| 10%過硫酸銨 | 0.02 |
| 總體積 | 10ml |
在分離膠聚合的過程（約30min）中，按下表配制5%的濃縮膠，注意TEMED應在灌膠前才加入。
| H2O 3.675（ml） 29%Acr+1%Bis 0.65 8×濃縮膠緩沖液(pH6.8) 0.625 10% SDS 0.05 TEMED 0.05 10%過硫酸銨 0.05 總體積 5ml |
分離膠聚合完全后，倒去乙醇，用濾紙吸干膠面上的殘余水。
灌注濃縮膠，立即插入干凈的梳子，避免產生氣泡。
濃縮膠聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取電極緩沖液清洗加樣孔數次，以除去未聚合的丙烯酰胺。將膠板固定于電泳槽上，上下槽各加入電極緩沖液。
② 上樣
將實驗11獲得的蛋白溶液按1：1比例加入2×SDS上樣緩沖液混合，100℃沸水浴10min。10000rpm離心1min，置冰上用上清液來點樣電泳。
用微量進樣器加樣，每個點樣孔中加入20μl樣品，同時點蛋白marker。每次應洗滌加樣器，最后在空白加樣孔中加入等體積的SDS樣品溶解液。
③ 電泳
裝好冷凝水系統，打開電源，電壓為100V，電泳直至染料到達離凝膠底部1cm處。
④ 染色：從電泳裝置上卸下膠板，小心橇開玻板取出凝膠，將膠板放入考馬斯亮藍R250染色液中染色2h以上。
⑤ 脫色：移出凝膠放入脫色液中脫色至本底無色為止。根據電泳結果分析誘導菌株有無表達目的基因。
(2) 雜交
① 將電泳后的膠板取出，裁取和膠等大的硝酸纖維素膜，按照：海綿-濾紙-膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿的順序裝入電轉印槽中，注意硝酸纖維素膜一定要朝向正極一側。
② 加入轉膜緩沖液，放在冰水浴中60V電壓（150mA）轉印2h。（整個過程應帶手套操作）
③取出硝酸纖維素膜用TBS沖洗一次。室溫下，在脫色搖床上用含10%脫脂奶粉的TBS封閉硝酸纖維素膜1h。倒掉封閉液，用TTBS(含0.1%的吐溫-20)洗膜10min。
④取1μl
anti-GST單克隆抗體（一抗），稀釋在500μl含少量脫脂奶粉（2%的奶粉）的TTBS（含吐溫-20，0.05%）中，將稀釋的一抗均勻點在一干凈的塑料膜（長和寬大約分別是膜的2.5倍和1.5倍）上，要求點一抗的面積同硝酸纖維素膜等大。小心地將硝酸纖維素膜有蛋白一側鋪在一抗上，注意排除氣泡，同時保持濕度。25℃放置2h（或4℃過夜）。
⑤ 用TBS洗膜2次，用TTBS（含吐溫-20，0.05%）洗1次，每次需持續約10min。
⑥ 取1μl
goat-anti-mouse-IgG-HRP（二抗），稀釋在500μl含2%的奶粉的TTBS（含吐溫-20，0.05%）中，同樣，將稀釋的二抗均勻點在一干凈的塑料膜上。小心地將硝酸纖維素膜有蛋白一側鋪在二抗上，注意排除氣泡，同時保持濕度。25℃放置1h。
⑦ TTBS（含吐溫-20，0.05%）洗膜4~5次，每次5min，將硝酸纖維素膜裝入雜交袋中，
⑧ 在EP管中按1ml BAD增強劑兌50μl DAB配制顯色液，配好的顯色液避光保存，30min內有效。
⑨在雜交袋中加入顯色液，室溫下顯色2～30min，當有清晰的棕褐色條帶出現時，用水沖洗硝酸纖維素膜終止反應，觀察并分析結果，干燥保存。