基本方案 培養以及小鼠外周血分裂相細胞收獲
1.對于每一個小鼠標本，用一個 16 mm X 125 mm 組織培養管，其內有： 0.95 ml RPMI； 0.1 ml PHA 溶液； 0.1 ml LPS 溶液（750ug/ml); 0.15 ml FBS。 接種前需冷藏。 2.用兩只 75u1 肝素化的微量毛細管分血器分別從每只小鼠的兩個眼眶靜脈竇采集血液 (圖 4.2.1; 體重 30 g 的小鼠可采集 300u1 血液）。接種至含有 0.1 ml 500 USPU/ml 肝素鈉的 12 mm X 75 mm 無菌管中。 注：如果不能熟練操作，可從小鼠尾靜脈采血（備選方案 1)。
3.旋緊管蓋，輕輕搖動管子，使血液與肝素充分混勻。室溫保存（不超過 2 h)，直至接種至培養基。 4.接種 0.2 ml 肝素化血液至準備好的培養管中。旋緊管蓋，輕輕搖動管子，使細胞與培養基混勻。
5.將培養管傾斜奶°角（傾斜有利于氣體交換，且防止細胞沉積），于 3rc 水浴搖床培養 41?43 h。設置搖床前后轉動速度為 32~35 次/min。平均每日至少用手搖勻培養管 3 次，使細胞重懸。 如果在染色體玻片上觀察到大章的有絲分裂前期細胞（核大而蒼白），表明細胞培養時間不充分。如果觀察到多數分裂晚期染色體，表明培養時間過長。 6.于每一個培養管中加人 50ug/ml 的秋水仙素溶液 0.15 ml，繼續 37℃ 培養 15~20 min。將培養基轉移至 5 ml 錐形玻璃離心管，室溫 400 g 離心 10 min。 7.棄上清，輕輕加入 2~3 ml 預熱的 0.075 mol/L KCl，用巴氏管輕輕吹吸混勻細胞，37°C 孵育 15 mm。室溫 500 g 離心 10 min。小心棄上清，勿觸及下層沉淀之上的棕茜 (白色）色薄膜。 8.于管底輕輕加入固定劑 3~4 ml，輕柔但迅速吹吸使其充分混勻。旋緊蓋子，室溫靜置至少 30 min，如有必要，可于 4°C 保存 2 h。 9.室溫 400 g 離心 lOmin，棄上清（固定劑），加入新配制的固定劑 2?3m 卜混勻細胞。 重復此第 2 步次。 10.將細胞室溫 400 g 離心 8 min 后，以 1/3~1/2 ml 新鮮固定劑重懸細胞。如果不立即制備染色體玻片，可不進行最后的步驟，直至制備玻片之前再進行。如果隔日制備玻片，過夜前應洗滌細胞至少 2 次。 11.制備染色體玻片目 ij，將玻片浸入固定劑 15 min 以上，用 Kimwipe 或不含棉絨紙擦干。 12.用巴氏管將小滴細胞懸液滴加至玻片上，并使其分散。如果在玻片邊緣出現水泡，則應減少滴加量。一旦液滴開始收縮，出現牛頓環（液滴邊緣出現彩虹顏色，因色差而起著色現象），應立即吹干或搖動玻片使其迅速晾干，此步驟對于獲得分散良好的中期染色體至關重要。、選擇方案：要增加染色體的分散度，可將玻片平置，在細胞懸液開始晾干時滴加很小的一滴固定劑（如「炸彈，，方法）。 13.重復第 12 步，直至將所有樣品都滴加至玻片上（多加幾滴稀釋的細胞懸液的效果優于只加幾滴濃縮的細胞懸液），于相差顯微鏡下觀察細胞的濃度以及染色體的分散程度。以細胞的濃度來評價玻片制備的優良，而不是以分裂相的多少作為指標。 14.在進行 G 顯帶之前，可將玻片在室溫保存 7~10 d(基本方案 2)。進行 FISH 分析，可室溫存放玻片 2?4 周（本文作者應用干燥器），以防止過度變性。如要長期保存 (如 4 周至 1 年），應將玻片-20°C 冷凍保存。 備選方案1 由尾靜脈采集血液
備選方案2 由胚胎肝臟制備染色體
支持方案 小鼠定時交配
備選方案3 由骨髓制備染色體
備選方案4 從成體組織或實體瘤組織制備染色體
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