小鼠胚成纖維細胞的培養和體外分化_MEF滋養板的制備

絲裂霉素 C

胰酶溶液PBS明膠溶液

MEF 生長培養基組織培養皿

1. 準備下列材料

MEF 生長培養基

胰酶溶液

無 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ PBS

絲裂霉素 C

明膠溶液（0.1%）

150 mm 組織培養皿

滋養細胞組織培養皿

2. 準備一支 15 ml 離心管，加 5 ml 預熱（37℃）MEF 生長培養基。取一支液氮凍存的 MEF 細胞，37℃ 水浴中輕輕振蕩，細胞融化后轉移到離心管中。

3. 離心收集細胞，懸于 10 ml MEF 生長培養基，接種 150 mm 組織培養皿，加 MEF 生長培養基至 25 ml。37℃ 孵育至細胞長滿（約 2~3 天）。

4. 細胞長滿后加入絲裂霉素 C。吸掉培養基，加入新配制的含絲裂霉素 C（10 μg/ml）的 MEF 生長培養基。37℃ 孵育 2.5 小時。

5. 孵育同時準備明膠處理的滋養細胞培養皿。

(1) 0.1% 明膠溶液覆蓋空的組織培養皿底，室溫保溫 15 分鐘。

(2) 倒掉明膠溶液，培養皿晾干，平放待用。

6. 去掉培養基，10 ml PBS 沖洗三次，完全去除絲裂霉素 C，加 10 ml 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分鐘。

7. 加 3 ml MEF 生長培養基，吹吸分散細胞，轉移至 15 ml 離心管。

8. 離心收集細胞，懸于 10 ml MEF 生長培養基，計數細胞。

9. 絲裂霉素處理的 MEF 細胞以合適密度接種明膠包被培養皿。