小鼠胸腺細胞增殖3HTdR摻入法檢測IL1的生物活性

實驗概要

IL-1可協同有絲分裂原(如ConA或PHA)刺激的T細胞或胸腺細胞發生增殖反應，通過³H-TdR DNA摻入法，即可測定IL-1生物活性。此法是目前測定IL-1活性常用而簡便的方法，其敏感度達10-50pg/ml。但本法缺乏特異性，因為IL-1亦可刺激T細胞或胸腺細胞產生一些細胞因子(如IL-2等)，同樣可協同有絲分裂原刺激細胞增殖，且在細胞增殖過程中還可受到樣品中T細胞增殖抑制因子的干擾。

主要試劑

1. 75%酒精

2. 5% FCS-RPMI-1640完全培養液與RPMI-1640完全培養液

3. ConA或PHA

4. IL-1標準品：倍比稀釋成至少6個不同濃度值。

主要設備

1. ³H-TdR、β-液閃汁數儀，微量細胞收集儀

2. 解剖刀、剪、單皿、研磨工具(玻璃勻漿器，不誘鋼網或者毛玻璃片，用于研磨小鼠胸腺)

3. 96孔細胞培養板

4. 刻度吸管，毛細吸管，刻度離心管、離心機、細胞計數板，倒置顯微鏡，加樣器(頭)，50%CO₂培養箱，超凈工作臺

實驗材料

1. 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周齡，雌雄均可。

2. IL-1待測樣品：倍比稀釋成至少6個不同濃度值。

實驗步驟

1. 準備工作與ConA或PHA亞適劑量的確定

測定樣品前必須作ConA或PHA的劑量曲線，觀察其對小鼠胸腺細胞增殖的影響，選擇一個既能夠激活胸腺細胞，但又不引起其明顯增殖的合適劑量，即亞適劑量。

   1) 在96孔培養板各孔中加入小鼠胸腺細胞，100μl/孔；

   2) 加入不同濃度的ConA(或PHA)，100μl/孔，使其終濃度分別為0.5μg/ml，1μg/ml ，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，各設三復孔，以不加ConA的培養液作對照；

   3) 置37℃，5% CO₂培養箱中培養72h，收獲前12h加入³H-TdR，0.5μci/50μl/孔；

   4) 用微量細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維紙上，用β-液閃計數儀測定各孔cpm值；數據(cpm)以三個復孔平均值 標準差表示，

   5) 數據(cpm)以三個復孔平均值 標準差表示，繪制ConA劑量曲線，據此選擇亞適劑量，通常為0.2-2.0μg/ml)(終濃度)；

2. 操作步驟

   1) 拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5min，消毒處理；

   2) 無菌操作取出小鼠胸腺，放入含有RPMI-1640完全培養液的平皿中；

   3) 將胸腺剪碎(或研磨工具磨碎)，無菌紗布過濾，制成單個胸腺細胞懸液；

   4) 用PRMI-1640完全培養液洗滌上述細胞2次，1500r/min離心10min，然后用5% FCS-RPMI-1640完全培養液調細胞濃度為1.5×10⁷/ml；

   5) 在96孔培養板各孔中加入小鼠胸腺細胞，100μl/孔；

   6) 將倍比稀釋后的標準品與待測樣品加到上述各孔中，100μl/孔，一式3份，設培養液對照及有絲分裂原對照。

   7) 將預先確定的亞適劑量的ConA(終濃度約0.2~2.0μg/ml)或PHA(終濃度為約0.5~4.0μg/ml)加入96孔培養板中，100μl/孔。

   8) 置37℃，5% CO₂培養箱中培養72h，收集前10-12h加入³H-TdR 0.5uci/50ul/孔。

   9) 用微量細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維紙上，用β液閃計數儀測定各孔³H-TdR摻入量(cpm值)。

注意事項

1. 所制備的小鼠胸腺細胞存活率應>95%。

2. 標準品及待測樣品應以1:2開始至少6個倍比稀釋度。

3. 加樣時，應以低濃度到高濃度順序加入，且不可共用加樣器頭。

4. 由于受其他細胞因子的影響，本法特異性受到一定限制。

5. 亦可用D10G4.1細胞(小鼠T輔助細胞克隆)代替上述小鼠胸腺細胞進行IL-1生物活性檢測，基本方法相同。但由于D10G4.1細胞對IL-1的敏感性大大增強，而對IL-2相對不敏感，且對IL-1的敏感性比對IL-2的敏感性大100~1000倍，故本法敏感性與特異性均較小鼠胸腺細胞增殖法。