小鼠腹腔巨噬細胞培養實驗

小鼠

1640 培養基 小牛血清 雙抗 臺盼蘭

手術器械 一次性注射器 眼科鑷 眼科剪 96 孔板 CO2培養箱

一、實驗步驟

1. 如果采用刺激物，則可在實驗前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細胞數要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。

2. 拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2 分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。

3. 用注射器抽取5mL 含雙抗的RPMI 1640 培養基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中(個人認為，此法比用注射器抽吸好一些)。

4. 1000 rpm 離心5 min 后，用含雙抗的RPMI 1640 培養基洗滌一次，再次離心，重懸細胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培養液中，如果是作為飼養細胞使用，則選擇相應的培養液。臺盼藍拒染法計數，將細胞稀釋到目的濃度后，接種即可。

5. 如果是作為飼養細胞使用，調整濃度至2x10⁵個/mL，接種到96 孔板中，每孔100-200μL；如 果作為其它實驗使用，可以調整成2x10⁶/mL，加到 24 孔平底培養板中，1 mL/孔；5% CO₂溫箱孵育2 h 后， 換液，并用RPMI 1640 培養基洗1-2 次，棄去未粘附細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。

二、結果
 

巨噬細胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細胞有吞噬的特性，當與細菌混合在一起的時候，在40 倍物鏡下可以看到巨噬細胞吞噬細菌，因此，巨噬細胞作為飼養細胞可以清除部分污染的細菌、支原體和部分細胞碎片。

1. 嚴格無菌操作，在超凈臺內進行；

2. 為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器；

3. 吸管吸取細胞懸液的時候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細胞污染。 

巨噬細胞一般沒有特殊的鑒定方法，有兩條經驗：

1. 巨噬細胞是終末分化細胞，不會增殖

2. 很難消化下來，所以接種的時候，必須直接接種到目的培養器皿中。