層析技術(色譜法,Chromatography)概念、分類和操作(1)

層析技術概述
引言
層析法又稱色層分析法或色譜法(Chromatography)，它是在 1903~1906年由俄國植物學家M. Tswett首先提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現了不同顏色的譜帶或稱色譜圖(Chromatogram)。
當時這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應用到分離復雜的有機混合物，人們才發現了它的廣泛用途。隨著科學技術的發展以及生產實踐的需要，層析技術也得到了迅速的發展。為此作出重要貢獻的是英國生物學家Martin 和Synge，他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數基礎上模擬蒸餾理論，以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據液－液逆流萃取的原理，發明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠見卓識的預言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數)，這將會大大提高分離效率。前者預見了氣相色譜的產生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預見了高效液相色譜(HPLC)的產生，在60年代末也為人們所實現，現在HPLC 已成為生物化學與分子生物學、化學等領域不可缺少的分析分離工具之一。

因此，Martin 和Synge 于1952年被授予諾貝爾化學獎。如今的色層分析法經常用于分離無色的物質，已沒有顏色這個特殊的含義，但色譜法或色層分析法這個名字仍保留下來沿用。現在我們簡稱為層析法或層析技術。層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用于少量物質的分析鑒定，又可用于大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用于科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫藥衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。
層析的基本理論
層析法是一種基于被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(或稱分配常數)不同，達到彼此分離的目的。
對于一個層析柱來說，可作如下基本假設：
①層析柱的內徑和柱內的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個理論塔板。塔板一部分為固定相占據，一部分為流動相占據，且各塔板的流動相體積相等，稱為板體積，以Vm 表示。
②每個塔板內溶質分子在固定相與流動相之間瞬間達到平衡，且忽略分子縱向擴散。
③溶質在各塔板上的分配系數是一常數，與溶質在塔板的量無關。
④流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程 (即不連續過程)。從一個塔板到另一個塔板流動相體積為Vm。當流過層析柱的流動相的體積為V 時，則流動相在每個塔板上跳越的次數為n:n1=v:v1。
⑤溶質開始加在層析柱的第零塔板上。根據以上假定，將連續的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當于一個兩相平衡的小單元。
層析的基本概念
(1)固定相
固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質(如吸附劑，凝膠，離子交換劑等)，也可以是液體物質(如固定在硅膠或纖維素上的溶液)，這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關鍵的作用。
(2)流動相
在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。
(3)分配系數及遷移率(或比移值)
分配系數是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量(濃度)的比值，常用K 來表示。分配系數是層析中分離純化物質的主要依據。
K = Cs / Cm
其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動相中的濃度。
遷移率(或比移值)是指：在一定條件下，在相同的時間內某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf 來表示。(Rf 大于或等于1)可以看出：K 增加，Rf 減少；反之，會減少，Rf 增加。
實驗中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內，某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx 來表示。不同物質的分配系數或遷移率是不同的。分配系數或遷移率的差異程度是決定幾種物質采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。

分配系數主要與下列因素有關：①被分離物質本身的性質；②固定相和流動相的性質；③層析柱的溫度。對于溫度的影響有下列關系式：
lnK = －(ΔG0/RT)
式中： K 為分配系數(或平衡常數)；
ΔG0為標準自由能變化；
R 為氣體常數；
T 為絕對溫度。
這是層析分離的熱力學基礎。一般情況下，層析時組分的ΔG0為負值，則溫度與分配系數成反比關系。通常溫度上升20℃，K 值下降一半，它將導致組分移動速率增加。這也是為什么在層析時最好采用恒溫柱的原因。有時對于K 值相近的不同物質，可通過改變溫度的方法，增大K 值之間的差異，達到分離的目的。
(4)分辨率(或分離度)
分辨率一般定義為：相鄰兩個峰的分開程度，用Rs 來表示，如圖2—20。
圖 2－20 計算分辨率示意圖
VR1—:組分1從進樣點到對應洗脫峰值之間洗脫液的總體積。
VR2— 組分2從進樣點到對應洗脫峰值之間洗脫液的總體積。
W1—組分1的洗脫峰寬度。
W2—組分 2的洗脫峰寬度。
Y—組分1和組分2洗脫峰值處洗脫液的總體積之差值。
分辨率：
由上式可見，Rs 值越大，兩種組分分離的越好。當Rs = 1時，兩組分具有較好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達到99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時，這時 為了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：
①使理論塔板數N 增大，則Rs 上升。
1)增加柱長，N 可增大，可提高分離度，但它造成分離的時間加長，洗脫液體積增大，并使洗脫峰加寬，因此不是一種特別好的辦法。
2)減小理論塔板的高度。如減小固定相顆粒的尺寸，并加大流動相的壓力。高效液相色譜(HPLC)就是這一理論的實際應用。一般液相層析的固定相顆粒為100mm；而HPLC 柱子的固定相顆粒為10mm
以下，且壓力可達150kg/cm。它使Rs 大大提高，也使分離的效率大大提高了。