第三節 微生物的分離
經富集培養以后的樣品，目的微生物得到增殖，占了優勢，其他種類的微生物在數量上相對減少，但并未死亡。富集后的培養液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優勢的一類微生物中，也并非純種。例如同樣一群以油脂為碳源的脂肪酶產生菌，有的是細菌，有的是霉菌，有的是芽孢桿菌，有的不產芽孢，有的生產能力強，有的生產能力弱等等。因此，經過富集培養后的樣品，也需要進一步通過分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來。
一、好氣微生物的分離
分離的方法很多，大體可分為兩類：一類較為粗放，只能達到“菌落純”，如稀釋涂布法，劃線分離法，組織分離法等。前兩種方法由于操作簡便有效，工業生產中應用較多。組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株。另一類是較細的單細胞或單孢子分離方法，可達到“菌株純”或“細胞純”的水平。這類方法需采用專門的儀器設備，復雜的如顯微操作裝置，簡單的可利用培養皿或凹玻片作分離小室進行分離。下面對這幾種分離純化方法分別加以介紹。
（一） 稀釋涂布法
把土壤樣品以十倍的級差，用無菌水進行稀釋，取一定量的某一稀釋度的懸浮液，涂抹于分離培養基的平板上，經過培養，長出單個菌落，挑取需要的菌落移到斜面培養基上培養。土壤樣品的稀釋程度，要看樣品中的含菌數多少，一般有機質含量高的菜園土等，樣品中含菌量大，稀釋倍數高些，反之稀釋倍數低些。采用該方法，在平板培養基上得到單菌落的機會較大，特別適合于分離易蔓延的微生物。
（二） 劃線分離法
用接種環取部分樣品或菌體，在事先已準備好的培養基平板上劃線，當單個菌落長出后，將菌落移入斜面培養基上，培養后備用。該分離方法操作簡便、快捷，效果較好。
在樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下，微生物的純種分離方法可以簡化如下：第一種方法，取一支盛有3～5ml無菌水的粗試管或小三角瓶，取混勻的樣品少許（0.5g左右）放入其中，充分振蕩分散，用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養，或者用接種環接一環于平板上劃線培養。這種方法不需要菌落計數，比以上常規稀釋法簡便。第二種方法，取風干粉末狀的土樣少許（幾十毫克）直接灑在選擇性分離培養基平板上或混入培養基中制成平板，置適溫培養一定時間，長出菌落。例如分離小單孢菌就可采用該方法，從河泥中取樣，風干研碎，取樣品粉末20～50mg直接加到天門冬酰胺培養基中，混合均勻制成平板，培養后長出魚卵狀菌落。這種方法有時分離不夠充分，可用劃線法進一步純化。
（三）利用平皿的生化反應進行分離
這是一種利用特殊的分離培養基對大量混雜微生物進行初步分離的方法。分離培養基是根據目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產物生化反應來設計的。通過觀察微生物在選擇性培養基上生長狀況或生化反應進行分離，可顯著提高菌株分離純化的效率。
1.透明圈法
在平板培養基中加入溶解性較差的底物，使培養基混濁。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產生透明圈，圈的大小初步反應該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產生菌時采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產生菌都會在含有底物的選擇性培養基平板上形成肉眼可見的透明圈。在分離淀粉酶產生菌時，培養基以淀粉為惟一碳源，待樣品涂布到平板上，經過培養形成單個菌落后，再用碘液浸涂，根據菌落周圍是否出現透明的水解圈來區別產酶菌株。如要分離該酸水解酶產生菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養基上把懸浮液涂抹培養，等長出菌落后覆蓋一層營養瓊脂，內含3%酵母RNA，0.7%瓊脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42℃左右培養2～4h,四周產生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產生菌。
在分離某種產生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法進行初篩。在選擇性培養基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進行培養，由于產生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產生菌時，由于乳酸是一種較強的有機酸，因此，在培養基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。
2.變色圈法
對于一些不易產生透明圈產物的產生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產生菌時，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產生菌時，可在培養基中加入溴百里酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.2～7.6，當pH在6.2以下時為黃色，pH7.6以上為藍色。若平板上出現產酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可以從這些產酸菌中篩選谷氨酸產生菌。
在進行解脂微生物的分離時，雖然有很多精確的測定方法，如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等，但由于步驟繁瑣，不適于大規模篩選測定。為提高分離篩選效率，多采用固體平板的變色圈法，如以吐溫為底物，尼羅藍（Nile blue）作為指示劑，根據變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物，羅丹明B為指示劑，以熒光圈的大小來測定。最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍和脂類底物混合，制成維多利亞藍乳脂瓊脂培養基平板，起始培養基調為中性，當土壤樣品的懸濁液分離在平板上，具有脂解能力的 菌落產生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽性解脂反應能顯示粉紅到藍色的變化。如培養基起始pH為堿性，則陽性解脂反應從咖啡色到藍綠色，能使脂類底物和解脂后的脂肪酸區別開來。后來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法，先在平皿內倒一層營養瓊脂，把一張棉紙圓片在被維多利亞藍染了色的乳脂中浸濕，鋪在已凝固的瓊脂表面，然后覆蓋一薄層含樣品的營養瓊脂，保溫培養，解脂菌落就可以在棉紙中產生藍帶。
分解解脂細菌的培養基（％）為：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、瓊脂2.0、大豆油5.0、維多利亞藍4mg。
分離內肽酶產生菌，除了用酪蛋白作底物平板產生透明圈進行鑒別外，還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養基中，產生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚，后者能氧化生成藍色產物，根據呈色圈便可選出平板上產蛋白酶的菌落。培養基平板由兩層組成，底層含明膠1.2％，酵母汁0.1％，蛋白胨0.4％，瓊脂1.5％，待凝固后在其上覆蓋一層瓊脂，瓊脂含量為0.7％，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氫鉀緩沖液配制，配制濃度為0.083mol/L的吲羥乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上層瓊脂中倒平板。
通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產乙醇的菌株。在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上，覆蓋一層含有鹽類的瓊脂，該藍色物質在醇脫氫酶和NAD作用下（在少量乙醇存在時）反應產生的電子脫色。因此生成乙醇的菌落便顯出一個淡白色的圈，暈圈的大小可初步表示乙醇的產量。
3.生長圈法
生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產生菌。工具菌是一些相對應的營養缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養物的平板上進行培養，若某菌株能合成平板所需的營養物，在該菌株的菌落周圍周圍便會形成一個混濁的生長圈。如嘌呤營養缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養，周圍出現生長圈的菌落即為嘌呤產生菌。
同樣，只要是篩選微生物所需營養物的產生菌時，都可采用生長圈法，工具菌用 相應的營養缺陷型菌株，由于得到所需營養，凡是目的微生物周圍便會出現混濁的生長圈。
4.抑菌圈法
常用于抗生素產生菌的 分離篩選。通常抗生素的篩選要投入極大的人力、財力和時間。據估計，篩選1萬個菌株才能得到1株有用的生產菌。因此設計一個準確、迅速的篩選模型十分重要。
抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的 物質，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。采用該方法已經得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。
在青霉素菌種選育中，還可利用加入青霉素酶來篩選青霉素高產菌株，做法如下：將產黃青霉孢子進行誘變處理，致死率約為99％。分離于瓊脂平板上，控制孢子濃度，使長成獨立菌落，一直培養到青霉素產量達到頂峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鑒定菌枯草芽孢桿菌懸浮液中，鋪張于菌落平板表面，凝固后，培養17～20h。測量抑菌圈大小，根據有效指標（抑菌圈直徑于菌落直徑之比）選出高產突變株。
由于現有抗生素種類多樣，得到新的抗生素越來越困難。人們除了從一些特殊的 地方如極端環境中采樣分離抗生素的 產生菌，也采用一些特殊的篩選方法，以期從普通土樣中分離篩選倒新的微生物及新的抗生素。除上述的抑菌圈外，稀釋法、擴散法、生物自顯影法等也不同程度的得到應用。在這些方法中，檢驗菌的選擇十分重要，直接關系到檢出的靈敏度和篩選到的抗生素的活性和抗菌譜。如在篩選抗細菌抗生素時，傳統上常用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為檢驗菌來檢驗抗生素的抗性。采用聯合檢驗菌，如枯草桿菌和綠色產色鏈霉菌活巴氏梭菌，可分離出抗菌活性低、對其他試驗菌活性高的新抗生素，如黃色霉素族的抗生素，而這些抗生素在單獨使用枯草桿菌時無法檢出。
海洋是新抗生素的重要來源。許多海洋生物體內都含有微生物，這些微生物為宿主抵御病害起著關鍵作用。因此，從魚組織和蝦消化道里分離篩選抗癌藥物和抗炎癥藥物是一個有效地途徑。已從水母體內篩到一種名為salinamide的抗生素，一種抗真菌抗生素istatin也從海洋生物體中分離出。
在篩選抗霉菌抗生素時，需根據其特點進行篩選，因霉菌與哺乳動物細胞性質相似，為減少藥物對人體的副作用，需挑選對霉菌有抗性但對人體安全的抗生素。由于哺乳動物不含幾丁質，因此可先篩選抑制幾丁質合成酶的生理活性物質，再從中篩選所需抗生素。三國霉素和多氧菌素就是通過該方法篩選得到的。抗病毒抗生素及抗腫瘤藥物的篩選則可通過敏感細菌培養平板的噬菌斑來判斷。
采用抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，而且還能篩選某些酶類。
四）組織分離法
組織分離法是由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法。如從患惡苗病的水稻組織中分離赤霉素，從根瘤中分離根瘤菌及從各種食用菌的子實體中分離孢子等。
1.對一般有病組織的分離方法
切除小塊含菌組織，用干凈水洗去組織表面污物。以10％漂白粉或0.1％升汞浸泡2～5分鐘進行表面消毒，無菌水沖洗。將消毒后的組織移到平皿培養基上，置于適宜溫度（25～26℃）培養一定時間，即可在組織周圍四÷長出微生物。用肉眼或顯微鏡觀察菌落，基本確認后挑入斜面培養基中培養。由這種方法挑選的菌株往往不純，必須在瓊脂平板上再分離純化，然后挑取單個菌落于斜面，進一步篩選。
從豆科植物的根瘤中分離根瘤菌：取新鮮健壯的根瘤，經漂白粉或升汞溶液等進行表面消毒后，用無菌鑷子將根瘤壓破，取出汁液少許與分離培養基混合倒入平皿中，攤平，培養后在平板上長出菌落，經鏡檢觀察后確認典型菌落，移入斜面。
2.食用菌孢子分離法
食用菌的孢子分離法通常有兩種，即多孢子分離和單孢子分離。多孢子分離有混雜現象，不易篩選到優良穩定的菌株。因此，從育種角度最好采用單孢子分離。兩種方法的分離步驟、方法介紹如下：
（1）多孢子分離法
取產量高、朵大、健壯無病并即將成熟的初生和單生子實體，用清水洗凈表面污物，對子實體外有膜保護著的菇類，如蘑菇、草菇，在0.1%～0.2%升汞溶液浸泡2～3 min，用無菌水沖洗數次。對子實體無膜外露的平菇等，不適于用升汞溶液浸泡，要用75%的酒精進行表面消毒，再用無菌水沖洗。食用菌的孢子著生在子實體的腹面的菌褶上，成熟時會自動彈出來。孢子采集裝置：用一條兩端彎成鉤的鐵絲，一端鉤著一塊成熟的蠶豆大子實體，另一端掛在三角瓶的瓶口上。三角瓶內事先制備好馬鈴薯—蔗糖培養基平板。懸掛的子實體距離培養基平板2～3cm。適溫培養1～2天，就有孢子陸續彈落于三角瓶底部的培養基上，經過4～5天，孢子萌芽成菌絲，及時將菌絲尖端接入到斜面培養基上培養，然后進行生產性能對比試驗。
（2）單孢子分離法
取一條鐵絲，彎曲成蚊香支架形狀，放在已消毒的玻璃板上。將消毒后的子實體懸掛在支架上方，下方置一個已滅菌的去蓋的培養皿，然后罩一個鐘罩，周圍縫隙用凡士林封好。將這套孢子收集器移到恒溫室內培養1～2天，將有大量孢子彈到平皿上，收集孢子（圖6.2）。以上操作全部在超凈臺或無菌室內進行。將收集到的孢子用稀釋法在馬鈴薯—蔗糖培養基平板上進行單孢子分離，培養后把單孢子長出的菌落移接到斜面上，進行生產性能比較試驗。
（五）單細胞或單孢子分離法
采用特殊的儀器設備進行單細胞或單孢子的分離。具體方法有多種，現主要介紹檸檬酸產生菌采用的小滴分離純化方法。操作如下：將待純化的孢子懸液稀釋約為1500ml-1，用校正口徑的滴管（每毫升400滴）吸取孢子并均勻滴于無菌干燥蓋玻片上，將其小心翻轉于凹玻片的孔穴上，穴內加一滴已滅菌的培養液，蓋玻片和載玻片用凡士林密封。顯微鏡下觀察每個小滴，將只有一個孢子的小滴位置作好記錄，恒溫培養，挑取單菌落于斜面。
除用凹玻片，還可用濾紙進行單細胞或單孢子分離。具體作法如下：取與皿內徑大小一致的濾紙3～4層，浸在培養液中，取出放在空皿內，在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥，蓋好皿蓋，滅菌。將稀釋為1500ml-1的孢子懸液用上述滴管滴在濾紙上，每皿約點20點滴左右，經恒溫培養，每滴約出現10個菌落，將單菌落移接于斜面上。該方法能夠得到單細胞或單孢子，較為精確，但操作時要細，否則不易得到理想結果。
（六）特殊菌類——環保降解菌的分離
自然界存在著大量廢物及污染物，如多環芳烴（PAHs）、有機染料和顏料、表面活性劑、農藥、酚類和鹵代烴等。在分離篩選這類物質的降解微生物由于該物質為唯一碳源或氮源的培養基進行富集培養。不能利用該物質的微生物由于得不到營養被淘汰，能分解該物質 的微生物則正常生長。經過幾個月的連續培養后，將富集培養液劃線或涂布于分離平板上，便能篩選到所需的環保降解菌株。分離平板可采用該污染物為底物的鑒別培養基，通過水解圈變色圈進一步提高篩選效率。
采用該方法分離苯胺、DDT、甲基對硫磷（MP）石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。如王倩如等人從經甲胺磷農藥廢水長期馴化的活性污泥中，篩選到能高效降解甲胺磷農藥的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus crerus）和嗜中溫假單孢菌（Pseudomonas mesophilica），兩株混合菌對有機磷的去除率達99.7%。
在篩選環保降解菌時需注意，某些有毒污染物由于本身對微生物的生長有抑制作用，如果直接在培養基中加入該物質連續富集培養，可能效果不佳。這時就需根據不同的情況設計更合理的篩選模型。如Harris在分離以氯化物為氮源的細菌時，把浸透了KCN溶液的濾紙放到平皿蓋上，濾紙所產生的HCN蒸氣逐漸滲入含無機鹽的分離培養基，每天用新制備的浸濕KCN的濾紙更換，培養一段時間后，從平皿上長出的菌落中進行分離，便容易得到分解氰化物的菌株。
由于塑料工業的發展，環境中到處都有各種高分子包裝廢棄物，這些污染物多為不溶于水的高分子化合物，獲得其降解菌株較為困難。通常采用富集法進行篩選，如日本的小野勝道教授以低濃度聚乙烯作為富集培養基對土壤微生物進行馴化，分離到了三種能降解聚乙烯的細菌。在淀粉塑料的降解試驗中，采用加富土壤淹埋法，篩選到的降解微生物主要是霉菌與放線菌。這可能是因為絲狀體更容易深入共混物內部生長。尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均勻，由于聚乙烯的流動性好，因而在吹塑過程中膜表面的聚乙烯含量偏高，使細菌在初期很難降解這類共混物，所以在降解菌的研究方面應著重考慮霉菌與放線菌。除馴化培養進行降解菌的篩選外，還可采用階段式篩選法。如在分離聚乙二醇降解菌時，可先篩選能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇結構相似的含兩個醚鍵的三甘醇的微生物，再從中篩選能降解聚乙二醇的菌株，也能達到較好的效果。
除尋找能夠降解廢舊塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代現有塑料。目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纖維素類生物降解塑料等。有些生物降解塑料是以簡單的物理共混工藝，將淀粉填充到聚乙烯等樹脂內，淀粉可以被微生物分解，但樹脂分子骨架在很長時間內仍分解不了，反而為廢棄塑料的回收增加了困難。而一些聚脂類高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羥基丁酯（PHB）相類似的結構，無毒，且能在酸、堿和微生物條件下完全降解，同時具有良好的塑性，用途寬廣的多。用微生物發酵法生產的聚β-羥基脂肪酸（polyhydroxyalkanoic acid,PHAs）也成為研究生物降解塑料的熱點，其中利用真氧產堿桿菌（Alcaligtnes eutrophus）合成PHB的研究最多。另外，還有固氮菌（Azotobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、生絲微菌（Hyphomicrobium X）、菌宿根瘤菌（Rhizobium meliloti）、嗜鹽桿菌（Halobacteria）等。目前人們已經克隆到PHAs合成途徑的關鍵酶基因，包括：phbA(β酮硫裂解酶基因)、phbB(依賴NADPH的乙酰CoA還原基因)、phbC（PHB合成酶基因）。許多實驗室已在進行酶基因導入E.coli的工作，期望利用E.coli大批量合成PHB。總之，利用廉價碳源的高產菌株的發現與選育是降解塑料領域中最有意義的研究之一。