[第一條鏈cDNA合成]
1.合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入：
10×第一條鏈合成緩沖液5.0μl
10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(終濃度1.25mM)
Linkerprimer(1.4μl，終濃度100μg/μl)
DEPcH2O
RNaseblockⅡ(1U/μl)1.0
mRNA1~5μg
混合，離心20秒鐘，室溫放置10分鐘
2.加入逆轉錄酶至1500U/ml，補水到終體積50μl。
3.混合，取出5μl 放入含有0.5μgα-32PdATP（800Ci/mM），分別保溫在37℃1小時。
4.保溫后，帶有同位素的離心管放入-20℃保存，為以后分析用。第一條鏈cDNA混合物放在冰上。
[第二條cDNA鏈的合成]
0.1MDTT8.0μl
10mMdNTPMix3.0μl
α-32PdATP（800Ci/mM）1.0μl
ddH2O115.0μl
2.混合后，加入：
RNaseH(4.0U/μl)1.0μl
DNA聚合酶（10.0U/μl）7.0μl
第二條鏈反應體積200μl，在16℃水中保溫2.5小時，注意水溫不得超過16℃，保溫后立即放在冰上。
3.反應混合物隨后用酚，氯仿提取
4. 用乙醇沉淀于，-20℃過夜。
5.次日，在4℃，以最大速度離心1小時。
6.用80%乙醇洗一次。
7.冷凍干燥cDNA。
8.最后沉淀物溶于43.5μl的ddH2O，取出4.5μl存入冰箱，作為第二條鏈分析用。
[填補cDNA末端]
1.在39μl的cDNA溶液中加入:5.0μl的10×T4DNA聚合酶緩沖液，2.5mMdNTP混合物。
2.反應物在37℃保溫30分鐘。
3.酚，氯仿提取。
4.酒精沉淀cDNA，-20℃至少沉淀30分鐘。
5. 在臺式離心機中，以最大速度4℃離心60分鐘。
6.80%乙醇洗滌沉淀。
7.冷凍干燥cDNA沉淀。
[連接]
1.在反應總體積10μl中，應有：
1μl10×連接緩沖液
1μl10mMATP
1μl(4WeissU/μl)
T4DNA連接酶，連接子或者Adapter
2.反應在8℃保溫過夜。
3.保溫后，反應離心管放于70℃30分鐘，以滅活 DNA連接酶。