差異表達cDNA的重新擴增、克隆與測序實驗

瓊脂糖凝膠蒸餾水DNA 點樣染料甘油蒸餾水溴酚藍二甲苯腈 FF溴化乙錠溶液任意引物（H-AP)cDNAdNTP 混合液未標記的錨定引物載體特異性引物PCR 緩沖液Tris-HClKClMgCl2明膠TaqDNA 聚合酶

電泳裝置離心管熱循環儀薄壁 PCR 管UV 透射儀微波爐

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

1.5% 瓊脂糖凝膠，加溴化乙錠 (見第 9 步）

蒸餾水

DNA 點樣染料

30% 甘油

70% 蒸餾水

0.003% 溴酚藍

0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)

溴化乙錠溶液（0.5ug/ml)

蒸餾水

重新擴增混合液（見第 7 步）

2. 核酸和寡核苷酸

任意引物（H-AP)(2 mmol/L)

cDNA(切割的條帶），來自方案 5

dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)

未標記的錨定引物（H-T11M)(2umol/L)

載體特異性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]

3. 酶和酶緩沖液

10XPCR 緩沖液

100 mmol/LTris-HCl,pH8.4

500 mmol/LKCl

15 mmol/LMgCl₂

0.01% 明膠

TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)

4. 專用設備

電泳裝置

1.5 ml 離心管

Parafilm

熱循環儀

0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)

UV 透射儀

微波爐

5. 附加試劑

PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404), 包括準備好插入的 PCR-TRAP 克隆載體、T4DNA 連接酶（200u/ul)、蒸餾水、10X 連接緩沖液（500 mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl₂，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差異顯示系統（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)

6. 細胞
GH-competent 細胞

7. 特別項目

含有抗生素的瓊脂平板（參考克隆系統推薦的專用抗生素與方案）

二、方法

1. 將方案 5 中切下的條帶，放到 1.5 ml 離心管中，加入 1ml 蒸餾水。

2. 浸泡 30 min，時常渦旋混勻。

3. 除去蒸餾水（不要丟掉條帶），再加入 50ul 新鮮的蒸餾水。

4. 將離心管蓋緊（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，將 cDNA 從凝膠中洗提出來。

5. 離心 lmin，濃縮并收集凝膠。

6. 將上清液轉移到一個新的 1.5 ml 離心管中，棄去裝有凝膠的管子。

7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列組分完成 cDNA 的重新擴增。

蒸餾水                                                  22.6ul

10XPCR 緩沖液                                    4.0ul
 
dNTP 混合液（250umol/L)                   1.0ul

H-AP 引物（2umol/L)                           4.0ul

H-T₁₁M(2umol/L)                                  4.0ul

cDNA 模板                                            4.0ul

Taq DNA 聚合酶                                    0.4ul

8. 將重新擴增的反應液放在熱循環儀上，以最初 PCR 條件（見方案 4 第 1 步）進行反應。

9. 配制含有溴化乙錠的 1.5% 瓊脂糖凝膠。

a. 在玻璃燒瓶中，稱 1.5 mg 超純的電泳級瓊脂糖。

b. 加 1XTAE 至 100 ml。

c. 將瓊脂糖放到微波爐中熔化。

d. 冷卻后，加入 3ul1:1 的溴化乙錠溶液。

e. 混勻后，倒入凝膠裝置中。

f. 放好梳子，等膠凝固。

g. 電泳緩沖液為 1XTAE 溶液（凝膠裝置不同，用量也不同）。

10. 在 0.5 ml 的離心管中，加入 30ul 的再擴增反應液和 5ul DNA 點樣染料。將混合液全部加到 1.5% 瓊脂糖凝膠上。

11. 在 70V 電壓下電泳大約 45 min。

12. 用 UV 透射儀進行觀察，以確認 cDNA 再擴增反應產物。

13. 按照廠商給的方案，將差異表達的 cDNA 克隆到推薦的 PCR-TRAP 克隆載體或其他合適的載體中。

14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的載體特異性引物進行測序。如果使用其他的克隆載體，請參考廠商的測序說明書。