帶您了解基因測序技術的發展

　　在生物多樣性急劇減少和物種消失的時代，有時被稱為“第六次大滅絕”或“全新世滅絕”，人們對開發有效的生物多樣性研究和監測工具提出了很高的要求。迄今為止，世界各地的分類學家已經描述了超過170萬個物種。然而，這只是地球上預計存在的數百萬生物的一小部分。當試圖使用傳統的基于形態學的方法對所有物種進行分類時，生物多樣性的絕對規模是一個巨大的挑戰。據估計，僅描述500萬種動物物種的成本就可能高達2500億美元，需要6個世紀才能完成。

　　基于形態的分類學充滿了局限性，例如難以描繪形態上隱蔽的物種以及合格的分類學家數量的減少。這些限制產生了對更多創新分類法方法的需求。2003年，Paul Hebert和他的同事展示了采用基于基因組的方法進行分類鑒定的方法。這種方法，被稱為“DNA條形碼”，是為了利用大多數真核生物中存在的短而保守的基因區域，提供快速準確的生物鑒定而開發的。從那時起，DNA條形碼已成為生物有機體快速鑒定的一種既定方法。

　　今天，第一代桑格測序被廣泛認為是DNA條形碼項目的“黃金標準”。當測序少于800個樣本時，它仍然是一種具有成本效益和準確的方法。然而，近年來，測序技術發展迅速。高通量，下一代測序(NGS)技術，如Illumina或Ion Torrent，使用戶能夠在單個測序實驗中多重處理數百個樣品，從而降低了成本，同時產生高度準確的測序數據。當將大量擴增子(數千個樣本)合并到一次運行中時，NGS的成本效益變得更加經濟實惠，盡管管理所有樣本和擴增子對于下游分析可能變得非常困難。然而，NGS測序技術的局限性在于它們只能對大約100-600 bp的短DNA片段進行測序。這比大多數首選的DNA條形碼(如CO1 (650 bp))要小，盡管最近的一項研究指出，長產品(主要基于引物選擇和Sanger測序限制，而不是嚴格的測試)不再需要準確性。最近，高通量第三代測序(TGS)平臺已經發布，使研究人員能夠對更長的reads進行測序，克服了NGS方法的局限性，同時保留了其優勢，即對數百個樣本進行多路復用，并為同一樣本獲得更多數據點。領先的TGS技術由太平洋生物科學公司(PacBio)和牛津納米孔技術公司(ONT)提供。

　　PacBio Sequel系列測序儀(Sequel I, II和IIe)使用單分子實時(SMRT)測序來生成高精度的長讀序列。在SMRT測序中，發夾接頭連接到雙鏈DNA模板上，形成一組封閉的環狀模板，稱為SMRTbell庫。測序引物被退火到SMRTbell文庫，以促進DNA聚合酶的結合，DNA聚合酶作為測序細胞底部的錨點，并標記出測序的初始位點。該循環模板被反復測序以產生子reads，然后在循環共識測序(CCS)模式下使用，以產生精度大于99.9%的HiFi reads。

　　ONT技術依賴于嵌入在導電膜中的蛋白質納米孔。當單個DNA鏈通過孔時，它們引起離子電流的變化，然后用于實時表征每個核苷酸堿基。該技術有多種配置的測序流式細胞和化學試劑，從可擴展的測序儀(例如Flongle, MinION流式細胞的廉價低容量替代品)到最高通量的PromethION流式細胞。目前，ONT使用新的Q20+化學和改進的堿基調用軟件，擁有99%的模態原始讀取精度。