五)免疫組化雙染色法。(ⅰ) (Ionmuno- Histochemistry double staimimg method)
1.切片脫蠟至水。
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
3.水洗。
4.抗原修復。
5.PBS洗3次，每次1分鐘。
6.加入非免疫性動物血清，孵育 10分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.加入第一抗體孵育60分鐘。
9.PBS洗3次，每次2分鐘。
10. 加入生物素化的第二抗體，孵育10分鐘。
11.PBS洗3次，每次2分鐘。
12.加入鏈卵蛋白素過氧化物酶孵育10分鐘。
13.PBS 洗3次，每次2分鐘。
14.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘。
15.PBS洗3 次，每次2分鐘。
16. 加入雙染增強液，孵育10分鐘。
17. 加入非免疫性動物血清孵育10分鐘。
18. PBS 洗3次，每次2分鐘。
19. 加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。
20. PBS洗3次，每次2分鐘。
21. 加入生物素標記的第二抗體孵育10分鐘。
22. PBS洗3次，每次2 分鐘。
23. 加入鏈卵蛋白素堿性磷酸酶孵育10分鐘。
24. PBS洗3次，每次2分鐘。
25. 加入AEC溶液，孵育5-10分鐘。
26. 自來水洗。
27. 蘇木素染核5-10分鐘。
28. 水性封片。
注：1. 第一種復合物也可先用鏈卵蛋白素堿性磷酸酶。
2.第1次顯色也可用BCIP/NBT溶液，顏色為藍黑色，但應與蘇木素鑒別。
(六)、免疫組化的雙染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)
1.切片脫蠟至水。
2.0.3%H2O2 甲醇處理切片10分鐘。
3.水洗。
4.抗原修復。
5.PBS洗3次，每次1分鐘。
6.加入選用的第一抗體孵育 30-60分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.加入增強劑孵育20-30分鐘。
9.PBS洗3次，每次2分鐘。
10. 加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育
11.PBS洗3次，每次2分鐘。
12.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘
13.PBS洗3次，每次2分鐘。
14.加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。
15.PBS洗3次，每次2分鐘。
16. 加入增強劑孵育20-30分鐘。
17. PBS洗3次，每次2分鐘。
18. 加入酶標抗兔/鼠堿性磷酸酶復合物孵育20-30分鐘。
19.PBS洗3次，每次2分鐘。
20.加入AEC溶液孵育5-10分鐘。
21.自來水洗。
22.蘇木素染核5-10分鐘。
23.水性封片。
(七)細胞培養片免疫熒光染色法。
1.將細胞于載片或蓋玻片的片子用生理鹽水洗幾次。
2.純丙酮固定10分鐘。
3.PBS 浸洗3次，每次1分鐘。
4.加入選用的第一抗體孵育120分鐘。
5.PBS洗3次，每次2分鐘。
6.加入熒光抗體孵育60 分鐘以上。
7.PBS法3次，每次2分鐘。
8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。
9.水洗，蒸餾水洗。
10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。
(八)真空負壓免疫熒光染色法染細胞培養片。
1. 將細胞爬于載玻片或蓋玻片的片子用生理鹽水浸洗數次，徹底洗去蛋白液。
2.純丙酮固定5-10分鐘。
3.PBS 浸洗3次，每次1分鐘。
4.加入選用的第一抗體孵育真空負壓處理15分鐘。
5.PBS洗3次，每次2分鐘。
6.加入熒光抗體孵育真空負壓處理15分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。
9.水洗，蒸餾水洗。
10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。