核酸分子雜交技術
由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質標記的，能與特定的核酸序列發生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據其來源和性質可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。
固相雜交
固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。
斑步雜交（dot hybridization）
是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；根據斑點雜并的結果，可以推算出雜交陽性的拷貝數。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。
印跡雜交（blotting hybridization）
Southern印跡雜交：凝膠電離經限制性內切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經干烤固定，再與相對應結構的已標記的探針進行那時交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量。可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態性分析（RELP）等。
Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。
差異雜交（differential hybridization）
是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉移性和非轉移性癌組織的mRNA逆轉錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應位置雜交信息以分離差異表達的基因。適用于基因組不太復雜的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低。但對基因組非常復雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5％左右），價值不大。
cDNA微點隈雜交（cDNA microarray hybridization）
是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產物以高度的列陣形式排布并結合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣，然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進行雜交。再利用熒光、化學發光、共聚焦顯微鏡等技術掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術的效率高、速度快、成本低，適用于大規模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序對雜交信息的干擾。
寡核苷酸微點隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）
是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價結合于支持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。
液相雜交（solution hbridization）
指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復合物。反應結束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。
遞減雜交（subtractive hybridizatio）
是利用兩種來源一致而功能不同的組織細胞提取mRNA（或逆轉錄成的cDNA）,在一定的條件下以過量的驅動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列。
核酸原位雜交
用特定標記的已知順序核酸作為探針與細胞級或組織切片中核酸進行復性雜交并對其實行檢測的方法，稱為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來檢測DNA在細胞核或染色休上的分布，與細胞內RNA進行雜交以研究該組織細胞中特定基因表達水閏；還用于細胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。
該法的優點是特異性高，可精確定位；能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細胞的形態。因此被廣泛應用于醫學生物學的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發展到定量，方法更為完善。
DNA分子克隆技術（也稱基因克隆技術）
在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（vecors）在細胞內自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結構與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomic library）,另一種是cDNA庫。
載體 所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。
細菌質粒 是一種細菌染色體外小型雙鏈環狀結構的DNA，分子大小為1-20kb，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質粒載體是在天然質粒的基礎上人工改造拼接而成。最常用的質粒是pBR322。
噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。
黏性質粒（cosmid） 是由質粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環狀雜種DNA。
表達型載體 將上述細菌質粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達型載體。
基因庫的建造
含有某種生物體全部基歷的隨機片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經過純化和擴增，可用于進 一步的研。其主步驟包括：（1）構建基因庫迅速的載體；(2)DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種。
cDNA庫的建造
是指克隆的DNA片段，是由逆轉錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫包括某特定細胞的全部cDNA克隆的文庫，不含內含子。
特異基因的篩選
常用的方法有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測法，檢測其分泌蛋白質來篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進行特異基因的篩選。
核酸序列測定
DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測序，sequencing）是分子生物學重要的基本技術。無論從基因庫中篩選的癌基因或經PCR法擴增的基因，最終均需進行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細結構，獲得其限制性內切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響，幫助人工俁成基因、設計引物，以及研究腫瘤的分子發病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世。化學降解法是在DNA的片段的5`端標記核素，然后用專一性化學試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應，這樣可得到一組結尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結尾的DNA片段，經凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據堿基互補原則，可推算出模板DNA分子的序列。
化學降解法只需一化學試劑，重復性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發明和運用，合成的引物容易獲得，測序技術不斷改進，故此法已被廣泛應用。基脫氧法的自動激光熒光測序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復性。至于RNA測序現大多采用將mRNA逆轉錄成cDNA后同測序，然后反推RNA序列
聚合酶鏈反應技術
聚合酶鏈反應技術簡稱PCR技術，是一種利用DNA變性和復性原理在體外進行特定的DNA片斷高效擴增的技術，可檢出微量靶序列（甚至少到1個拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。僅需用極少量模板，在一對引物介導下，在數小時 內可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應分三步：變性、退火及延伸。以上三步為一循環，每一循環的產物作為下一個的模板，這樣經過九小時的循環，每一循環的產物作為下一個循環的模板，這樣經過數上時的循環后，可得到大量復制的特異性DNA片段。反應條件一般為94℃變性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共進行30次循環左右，最后再延伸72℃5分鐘，4℃冷卻終止反應。
1.逆轉錄PCR(RT-PCR)用來擴增RNA的方法。
2.競爭逆轉錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。
3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR體系中加入多對引物可用于基天長度很長，發生多處缺失的檢測。擴增同一模板的幾個區域。
4.多種PCR可同時加入多套以生物素標記的引物起進手PCR反應。
5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）對一個已知的DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究。
6.不對稱PCR在擴增循環中引入不同引物濃度，以得到單鏈DNA并進行列測定，以了解目的基因的序列。
7.錨定PCR（anchored polymerase chain reaction）幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補的引物連接于一段帶限制性內切酶位點的錨上，在錨引物和基因另一側特異性引物的作用下，將未知序列擴增出來。
8.著色互補試驗或熒光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同熒光染粒，分別標記于不同寡核苷酸引物上，同時擴增多個DNA片段，反應完畢后，利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴增產物，就能顯示某一DNA區帶熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區帶熒光染色料顏色的組合，如果某一DNA區帶缺失，則會缺乏相應的顏色。
9.雙溫PCR（two-temperature PCR）僅僅執行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃。可以提高反應的速度和特異性。
上述這些PCR技術的應用：（1）PCR技術擴增特定序列為基礎，采用多種方法進行檢測，如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產生特異性序列作為分子探針；（2）通過選擇性擴增cDNA中產生特異性序列作為分子探針；（2）通過選擇性擴增cDNA中的特殊片段，產生針對尚未克隆的基因的探針；（3）從微量mRNA中產生cDNA文庫；（4）產生大量用于序列分析的DNA；（5）分析 基因突變；（6）做染色體步移。
10.原位PCR技術：PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA，但擴增的DNA或RNA產物不能在組織細胞中定位，因而不能直接與特定的組織細胞特征相聯系，這是該技術一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由于其敏感性問題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,簡稱IS PCR），它可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR和原位雜交的不足，具有良好的應用前景。目前，已有多種設計的原位PCR擴增儀系統問世，使操作簡便，軟件靈活，已成為拉增固定細胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。
IS PCR的技術特點
（1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準確性；（2）測到低于2個拷貝量的細胞內特定DNA序列，甚至可檢測出單一細胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA；（3）有助于細胞內特定核酸序列定位與其形態學變化的結合分析；（4）可用于正常或惡性細胞，感染或非感染細胞的鑒定與區別。
IS PCR的基本方法
IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術的綾事，實質是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再進行原位雜交的技術，操作程序基本兼有兩種技術的所有過程，首先在適當處理的細胞和組織切片上滴加PCR反應液，然后把載玻片放入熱循環儀中進行擴增，最后通過標記的探針進行原位雜交檢測擴增產物。
初步應用
有關原位PCR技術應用成功的第一篇報道是對感染綿羊中樞神經系統visna病毒在綿羊脈絡從一細胞中檢查，通過PCR擴增，僅用150堿基對的短探針就可通過ISH檢查到了細胞內的visna病毒。從開始在試管內細胞行PCR擴增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統的標記探針的原位PCR法（間接法），也有將標記物先標記PCR的引物，讓標記物擴增后再行ISH檢查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能獲得統一，也即未能比較出哪一種方法最可靠簡便，各家報道的原位PCR技術中，在標本處理和種類上尚不同（細胞懸液、涂片、組織切片等），想檢測的靶核酸也不同（病毒或體細胞的DNA或mRNA），擴增的方法上有不同（單引物、多引物），最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）。這些還都有待在今后的工作中積累經驗，以求一致。
原位PCR應用的課題，目前正片于開始階段，還很局限，對人體B細胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細胞HLA-DQ不同亞型的測定，歸納起來，主要應用于兩方面；（1）檢測外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）內源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。
基因轉染技術
將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中，這種能力不但革新了生物學和醫學中許多基本問題的研究，也推動了診斷和治療方面的分子技術發展，并使基因治療成為可能。目前基因轉移技術已廣泛用于基因的結構和功能分析、基因表達與調控、基因治療與轉基因動物等研究。本部分將介紹目前基因轉移的主要方法；重點介紹基因轉移的病毒方法的基因轉染（transfection）技術。
基因運載系統
將某一特定的靶基因傳遞到靶細胞，需要應用某一基因運載系統，目前將這一系統概括為兩大類：非病毒辣方法和病毒方法。
1.基因轉移的非病毒方法
直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細胞攝入DNA燕進行表達，在肌細胞中，基因表達可持續數月。
磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細胞膜并經過細胞內吞作用耐是入細胞質。該方法的轉化效率通常很低。
脂質體染法 指質體能在體內或體外提供運載外源性遺傳物質進入細胞的載體。脂質體介導的基因轉移的最大優勢在于能在活體內應用。
受體介導的基因轉移 依靠受體介導的細胞內吞途徑以轉移外源基因。受體介導的基因轉移方法是在質粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復合體，而這種多肽能為細胞表面的肥體所識別。如若將DNA在體內運送至肝內，可以選將DNA和能與肝細胞受體特異結合的去唾液酸糖蛋白質偶聯，以便通過細胞內吞過程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝取。應用該方法轉移的外源基因在活體內的表達持續時間較短，在評估實際應用前影上還在一些問題。
顯微注射法 在顯微鏡下，將DNA經同細胞玻璃針地接注入細胞，該法適合于各種培養生長的細胞，但需要一定的設備和操作用支巧。
電穿孔法 利用脈沖場將DNA導入培養細胞。
微粒子轟擊法（基因槍）近幾年發展較快的轉移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導入培胞或活的哺乳動物組織內。亞微粒的鎢和金能自發地吸附DNA，將這些微彈加強速到很的速度轟