細胞懸液制備后,要計算所含的細胞數量。一般以細胞數/毫升表示。
用品:細胞懸液 培養液 計數板
程序
用酒精沖洗計數板后 擦凈,將蓋片覆在計算板上,微微移向一側,以便滴加細胞懸液.
取一吸管伸入培養瓶,輕輕吸打細胞懸液混勻。
從蓋片邊緣滴加細胞懸液,使其充滿計數板和蓋片間的空隙中
注意:勿使液體漫過蓋片或出現氣泡。
鏡下觀察計數 計算計數板的四角大格內的細胞數,壓線者只計算左側和上方的,右和下的不計算在內。
按下式計算:
細胞數/毫升源液=
注意:
鏡下計數,有時偶爾有兩個以上細胞組成的細胞團,應按單個細胞計算如細胞團占10%以上,說明消化不充分,或細胞數少于200個/10平方毫米或多于500個/10平方毫米時,均說明稀釋不當.需重新置備細胞懸液,再計算。
培養細胞的凍存
在培養液中添加保護劑,如二甲亞砜(Dimeethylsulfoide,DMSO)甘油,可使細胞免受低溫冰晶形成及滲透壓改變而導致的物理損傷,培養細胞可長期保存于液氮(-190攝氏度)中。
用品
細胞凍存管 保護劑(甘油或二甲亞砜) 培養液,血清,液氮罐
步驟
培養細胞從增殖期到形成致密單層以前的細胞都可用于冷存,zui好是處于對數生長期(即繁殖期)的細胞按比例混合培養液血清(一般20%)凍存液(10-20%)制成凍存緩沖液,到出培養液,消化細胞。由于細胞濃度低時失活較顯著,因此需將細胞濃度調到
為宜,取1-2ml加入凍存管,做好標記。一般而言,細胞以1-10攝氏度/分的速度下降凍結為宜,在沒有程序控制凍存器設備的條件下,可先將凍存液細胞置于4攝氏度冰箱4h,然后移入液氮容器的氣相液氮中1h,速侵入液相液氮(-190攝氏度)中.能獲得較好的復蘇率。
細胞的復蘇
凍存細胞的復蘇以急速融化為原則,使培養物能快速通過對細胞有損害的-50~0攝氏度區域。
培養細胞計數法:
細胞的復蘇步驟
從液氮取出凍存細胞,立即投入盛有38攝氏度溫水的容器內,搖動凍存管,使其內容物在20-60秒內完全融化成懸液。無菌下打開凍存管,
接種于培養瓶中,加入新鮮培養液,37攝氏度孵箱培養24 hr更換培養液去除凍存液,繼續培養。
細胞凍存管,保護劑,培養液,血清,液氮罐,逐一彈出取培養細胞-傾倒培養液-加胰酶消化-計數-配置凍存液-加入凍
存管放入4攝氏度冰箱-液氮瓶口(氣相)。
從液氮取出凍存管-投入水容器-于超凈臺內打開-接種于培養瓶-放入孵箱中。。
細胞運輸
當前培養細胞既在國內進行寄憎,交換和購買,也在國際交流,為此需要裝運細胞的方法。一種是用液氮或干冰貯存運輸,
需要特殊容器,較麻煩,且不適于長時間運行。
另一方法為充液法,方便當行,是當前多采用的方法。
具體方法:
1選生長狀態良好的細胞,待培養近單層后,去掉培養液充滿新培養液。
液量要達培養瓶頸部,擰緊螺帽或塞一吸塞,保留微量空氣。
空氣留量過多,運輸時大氣泡來回流動對細胞有干擾作用。
一般經4~5天運輸對細胞活力無大影響。時間過長,細胞活力下降。
2到達后,倒出大部分培養液,保留維持細胞生長所需的液體量。
置37攝氏度培養,次日傳代。